藥物分析 第五章 抗菌藥物與抗生素類的分析-3

第五章抗菌藥物與抗生素類的分析第一節(jié)喹諾酮類藥物的分析一、基本結構與典型藥物

吡哌酸諾氟沙星

環(huán)丙沙星氧氟沙星

氟羅沙星依諾沙星

司帕沙星二、理化性質1.酸堿兩性2.與丙二酸的反應3.含鹵素氟4.紫外紅外光譜二、鑒別試驗（一）鹽的鑒別如甲磺酸培氟沙星：取本品約30mg，加氫氧化鈉0.2g，加水數滴，溶解后置酒精燈上，小火蒸干至炭化，加水數滴與2mol/L鹽酸溶液3~4ml，緩緩加熱，產生二氧化硫氣體，能使?jié)駶櫟牡馑徕浀矸墼嚰堬@藍色。

（二）與丙二酸的呈色反應如鹽酸左氧氟沙星片：

取本品細粉適量（約相當于左氧氟沙星10mg），置干燥具塞試管中，加丙二酸約10mg與醋酐0.5ml，在水浴中加熱5~10分鐘，溶液顯紅棕色。（三）有機氟化物的反應（四）光譜法（五）色譜法三、特殊雜質檢查

（一）溶液澄清度與顏色（二）酸度（三）吸光度（四）有關物質（五）光學異構體四、含量測定（一）非水堿量法（二）紫外分光光度法（三）HPLC法第二節(jié)β-內酰胺類抗生素

β-內酰胺環(huán)一、基本結構與典型藥物青霉素類頭孢菌素類青霉素類頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)-內酰胺環(huán)青霉素類6-氨基青霉烷酸（6－APA）***手性C酸性不穩(wěn)定酰胺側鏈青霉素（芐青霉素）

包括有青霉素鉀、青霉素鈉、普魯卡因青霉素。氨芐西林（氨芐青霉素）.阿莫西林（羥氨芐青霉素）.磺芐西林鈉

（磺芐青霉素鈉）頭孢菌素類7-氨基頭孢菌烷酸（7－ACA）**手性C酸性酰胺側鏈不穩(wěn)定UV頭孢氨芐.頭孢羥氨芐.頭孢拉定頭孢噻吩鈉二、性質1.酸性游離羧基酸性，易與堿成鹽。2.旋光性-手性碳3.紫外吸收特性青霉素母核無吸收，但通常其側鏈有吸收；頭孢菌素母核O=C-N-C=C，在260nm處強吸收。4.穩(wěn)定性

-內酰胺環(huán)為四元環(huán)，張力大，且酰胺鍵易水解，不穩(wěn)定。穩(wěn)定性與含水量和純度相關。

在水溶液中，易受酸、堿、酶、金屬離子或氧化劑的影響，發(fā)生水解和分子重排。二、鑒別

本類藥物的鑒別試驗，國內外藥典中主要采用的方法為IR、HPLC、TLC法。（一）色譜法1.TLC

與對照品比較Rf值與斑點顏色2.HPLC

與對照品比較tR值（二）光譜法1.IR法特征官能團：酰胺β-內酰胺2.UV法青霉素鈉1.羥肟酸鐵反應內酰胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反應頭孢哌酮

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水2ml與鹽酸羥胺溶液3ml，振搖溶解后，放置5分鐘，加酸性硫酸鐵銨試液1ml，搖勻，顯紅棕色。2.茚三酮反應△注射用頭孢拉定ChP（2015）TLC鑒別顯色劑:茚三酮3.三氯化鐵反應

酚羥基偶合呈色三氯化鐵頭孢羥氨芐

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品適量，加水適量超聲使溶解并稀釋制成每1ml中約含12.5mg的溶液，取溶液1ml，加三氯化鐵試液3滴，即顯棕黃色。4.各種鹽的反應

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉+Ac—→↓白

K+1.K+、Na+反應2.重氮化偶合反應普魯卡因青霉素普魯卡因H+水解重氮化偶合反應（五）微生物檢定法-對照品對照法

青霉素鈉

Ch.P（2000）【鑒別】（1）取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50g的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml，在37℃滅活1小時后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金色黃色葡萄球菌CMCC(B)26003的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。（一）聚合物高分子雜質指抗生素藥品中分子量大于藥物本身的雜質的總稱。分為內源性和外源性雜質。三、檢查外源性雜質：包括蛋白、多肽、多糖類雜質或其與抗生素的結合物。主要來于自發(fā)酵工藝。內源性雜質：自身聚合物。生產或貯藏過程中產生。聚合物檢查方法：

多用分子排阻色譜法。即根據分子量差異進行分離的凝膠色譜法。

凝膠色譜具有分子篩的作用，讓藥物分子自由的進入凝膠顆粒表面，而高分子雜質被排阻，不能進入顆粒內部；色譜過程中凝膠對藥物的吸附作用大于對高分子雜質的吸附作用，可使高分子雜質與藥物分離。頭孢呋辛酯-HPLC

異構體規(guī)定峰面積大小比值有關物質主成分自身對照法（二）異構體和有關物質青霉素鈉ChP（2015）【檢查】吸光度取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm的波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸光度應為0.80-0.88。（三）吸光度頭孢克洛含量測定

ChP（2015）【含量測定】填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相磷酸二氫鉀溶液–乙腈（92︰8）（pH3.4)對照品頭孢克洛（含頭孢克洛δ-3-異構體）兩者分離度應大于1.5四、含量測定（一）高效液相色譜法（二）紫外-可見分光光度法（三）羥肟酸鐵比色法第三節(jié)氨基糖苷類抗生素

以堿性環(huán)己多元醇為苷元，與氨基糖縮合而成的苷。一、基本結構與典型藥物

主要有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、巴龍霉素、奈替米星等。鏈霉素鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉雙糖胺絳紅糖胺2-脫氧鏈霉胺加洛糖胺慶大霉素慶大霉素C復合物：

慶大霉素C1

R1、R2=CH3

R3=H

慶大霉素C2

R1=CH3

R2=R3=H

慶大霉素C1a

R1、R2、R3=H

慶大霉素C2a

R1=R2=HR3=CH3二、性質1.溶解性多-OH，水溶性。2.堿性多-NH2，堿性，臨床上多用硫酸鹽。3.旋光性手性C。4.穩(wěn)定性OH-葡萄糖胺鏈霉糖OH-麥芽酚反應坂口反應5.UV

鏈霉素λmax=230nm。三、鑒別（一）茚三酮反應

氨基糖苷藍紫色茚三酮△硫酸妥布霉素注射液

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品lml，加0.2%茚三酮溶液約1ml，直火緩緩加熱約3分鐘，應呈紫色。（二）Molisch反應蒽酮阿米卡星ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍紫色。（三）N-甲基葡萄糖胺反應乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色硫酸新霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加鹽酸溶液（9→100）2ml，在水浴中加熱10分鐘，加8%氫氧化鈉溶液2ml與2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加熱5分鐘，冷卻后，加對二甲氨基苯甲醛試液1ml，即顯櫻桃紅色。（四）麥芽酚反應Fe3+H+紫紅色配位化合物

此反應為鏈霉素的特征反應。硫酸鏈霉素

ChP（2015）【鑒別】（2）取本品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨溶液（取硫酸鐵銨0.1g，加0.5mol/L硫酸溶液5ml使溶解）0.5ml，即顯紫紅色。（五）坂口反應鏈霉素鏈霉胍OH-鏈霉胍+NaBrO8-羥基喹啉+NaBrO橙紅色硫酸鏈霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至約15℃，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。（六）硫酸鹽反應多為硫酸鹽，顯硫酸鹽的鑒別反應。

（七）色譜法TLC、HPLC法（八）光譜法IR、UV法慶大霉素

BP

取硫酸慶大霉素10mg，加水1ml和40%的硫酸溶液5ml，在水浴中加熱100分鐘，冷卻，用水稀釋至25ml。取該溶液進行紫外掃描，在240-330nm范圍應無最大吸收。四、雜質檢查（一）有關物質（二）硫酸鹽測定

EDTA測定法或HPLC法（三）組分測定慶大霉素C組分測定:

慶大霉素為C1，C2，C1a，C2a的混合物，各組分對微生物的活性無明顯差異，但毒副作用和耐藥性不同，因此其相對含量影響產品的質量，需做控制（規(guī)定各組分的相對百分含量）。C125%-50%C1a15%-40%C2a

+C220%-50%要求：方法：HPLC

慶大霉素沒有紫外吸收，所以應先進行衍生化處理。λmax=330nmpH10.4巰基醋酸Ch.P（2000）ChP（2015）

蒸發(fā)光散射檢測器檢測BP

電化學檢測器檢測硫酸慶大霉素

ChP（2015）【檢查】慶大霉素C組分照高效液相色譜法（通則0512）測定。填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠(pH0.8~8.0)流動相0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92:8）檢測器蒸發(fā)光散射檢測器標準品慶大霉素、小諾霉素

小諾霉素與慶大霉素各組分峰應滿足分離度要求。

蒸發(fā)光散射檢測器（EvaporativeLight-scatteringDetector）是質量型檢測器，只與待測物質的量相關，無所謂其光學性質或電化學性質。因此對于許多沒有光學吸收特征的生物性物質的檢測，蒸發(fā)光散射檢測器提供了新一代的檢測方法。

一、霧化流動相與氮氣或空氣混合形成霧狀液體，即稱“液霧”。二、蒸發(fā)“液霧”中的易揮發(fā)的流動相氣化揮發(fā)，不易揮發(fā)的樣品形成微小顆粒。三、檢測流動相完全揮發(fā)，樣品的微小顆粒通過激光束時，造成光束散射。通過散射的光，產生電信號。ELSD檢測三步曲示意圖霧化蒸發(fā)檢測四、含量測定

主要采用微生物檢定法和HPLC法。

硫酸鏈霉素

ChP（2015）【含量測定】精密稱取本品適量，加滅菌水定量制成每1ml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法（通則1201）測定，1000鏈霉素單位相當于1mgC21H38N7O12。第四節(jié)四環(huán)素類抗生素DCBA氫化四駢苯衍生物一、基本結構與典型藥物弱酸性、UV弱堿性四環(huán)素（TC）金霉素（CTC）-氯四環(huán)素土霉素（OTC）-氧四環(huán)素多西環(huán)素（DOTC）-脫氧土霉素美他環(huán)素（METC）二、性質1.為兩性化合物酚羥基、烯醇基：酸性二甲氨基：堿性OH-難溶于水易溶于有機溶劑易溶于水難溶于有機溶劑游離四環(huán)素四環(huán)素鹽臨床上多用鹽酸鹽2.旋光性3.紫外吸收和熒光性質4.

與金屬離子絡合顯色含酚羥基和烯醇基，與金屬離子生成鹽或配位化合物。5.穩(wěn)定性-不同PH下的異構化或降解反應（1）PH2.0-6.0

差向異構化反應（可逆反應）四環(huán)素差向四環(huán)素土霉素、多西環(huán)素、美他環(huán)素不易反應。（2）PH<2.0酸性降解-H2O四環(huán)素脫水四環(huán)素pH＜2pH＜2四環(huán)素脫水四環(huán)素差向脫水四環(huán)素4-差向四環(huán)素（3）堿性下降解三、鑒別（一）HPLC法鹽酸土霉素

ChP（2015）【鑒別】（3）在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致（二）TLC法固定相：硅藻土EDTA：克服痕量金屬離子存在引起的拖尾現象。黏合劑：EDTA+甘油流動相：含EDTA

（三）IR法（四）UV法（五）化學鑒別法1.H2SO4反應鹽酸金霉素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加硫酸2ml即顯藍色，漸變?yōu)殚蠙炀G色，加水1ml后，顯金黃色或棕黃色。2.三氯化鐵反應酚羥基與三氯化鐵反應。鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【鑒別】（1）取本品約0.5mg，加硫酸2ml，即顯深紫色，再加三氯化鐵試液1滴，溶液變?yōu)榧t棕色。四、檢查（一）鹽酸四環(huán)素中有關物質

4-差向四環(huán)素脫水四環(huán)素差向脫水四環(huán)素土霉素鹽酸金霉素檢查方法：HPLC（加校正因子的主成份自身對照法）鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【檢查】有關物質取本品適量，加0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中，加0.01mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項下的色譜條件，取對照溶液10l注入液相色譜儀，調節(jié)檢測靈敏度使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液和對照溶液各10l，分別注入液相色譜儀。記錄色譜圖至主成份保留時間的2.5倍。供試品溶液色譜圖中記錄色譜圖至主成分如有雜質峰，按校正后的峰面積計算（土霉素、4-差向四環(huán)素、鹽酸金霉素、脫水四環(huán)素和差向脫水四環(huán)素的校正因子分別為1.0、1.42、1.39、0.48和0.62），分別不得大于對照溶液主峰面積的0.25倍（0.5%）、1.5倍（3.0%）、0.5倍（1.0%）、0.25倍（0.5%）、0.25倍（0.5%）。其他各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的0.5倍（1.0%）。（二）雜質吸收度

四環(huán)素類藥物產生異構化和降解反應后會發(fā)生顏色改變。檢查方法為規(guī)定一定溶劑、一定濃度、一定波長下雜質吸收度的限量鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）【檢查】雜質吸光度取本品，在20~25℃時加0.8%氫氧化鈉溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），置4cm的吸收池中，在530nm的波長處測定，自加0.8%氫氧化鈉溶液起5分鐘時，其吸光度不得過0.12（供注射用）。五、含量測定—HPLC法鹽酸四環(huán)素

ChP（2015）填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：醋酸銨溶液[0.15mol/L醋酸銨溶液-0.01mol/L的EDTA溶液-三乙胺（100:10:1）用醋酸調節(jié)pH至8.5]-乙腈（83:17）色譜系統(tǒng)適用性：制備四環(huán)素和有關物質的混合溶液，要求能完全分離。

屬于-內酰胺類的抗生素藥物有

A.青霉素

B.紅霉素

C.頭孢菌素

D.慶大霉素

E.四環(huán)素

四環(huán)素在堿性條件下的降解產物是

A.差向四環(huán)素

B.脫水四環(huán)素

C.異四環(huán)素

D.去甲四環(huán)素

E.去甲氧四環(huán)素

鏈霉素的