RNA干擾對流感病毒NP和PA基因表達及病毒增殖的抑制

RNA干擾對流感病毒NP和PA基因表達及病毒增殖的抑制【摘要】目的：應用RNA干擾技術研究針對流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表達及抑制流感病毒在MDCK細胞中的增殖.方法：分別構(gòu)建針對NP，PA及同時干擾NP和PA的三種siRNA表達質(zhì)粒pEGFP/NP，pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，轉(zhuǎn)染MDCK后，H5N1亞型流感病毒感染細胞，熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率，蛋白質(zhì)印跡和半定量RTPCR檢測NP及PA蛋白表達及基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，并在不同時間點檢測細胞培養(yǎng)上清中的血凝值，觀察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.結(jié)果：熒光顯微鏡結(jié)果表明，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達%.蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK細胞內(nèi)的表達，兩者的抑制率分別為%和%.半定量RTPCR檢測到pEGFP/NP質(zhì)粒在MDCK細胞內(nèi)對NP基因的轉(zhuǎn)錄抑制率為%；pGenesil/PA質(zhì)粒對PA基因的轉(zhuǎn)錄抑制率為%；pEGFP/NP+PA質(zhì)粒對NP和PA基因的轉(zhuǎn)錄同時抑制率，分別為%和%.而對照質(zhì)粒pEGFP/HK對NP或/和PA基因的蛋白表達及轉(zhuǎn)錄均沒有抑制作用.HA結(jié)果表明，三種質(zhì)粒均能抑制流感病毒在MDCK細胞中的增殖，以pEGFP6/NP+PA的作用最為顯著，它們抑制流感病毒增殖的能力分別為%，%和%.結(jié)論：NP或/和PA基因的siRNA質(zhì)?？擅黠@抑制NP或/和PA基因的轉(zhuǎn)錄和表達，并有效地抑制流感病毒在MDCK細胞中的增殖.

【關鍵詞】RNA干擾；正粘病毒科；MDCK細胞株；NP基因；PA基因

0引言

近來，禽流感在世界各地頻繁爆發(fā)，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［1］，也嚴重威脅到人類的健康［2］.高致病性的H5N1亞型是較為嚴重的一類［3］.而現(xiàn)有的、針對HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亞型出現(xiàn)時卻無能為力［4］.我們利用RNA干擾技術(RNAinterference,RNAi)［5］，選擇在A型流感病毒復制過程中起重要作用的RNA聚合酶PA或/和核蛋白(nucleoprotein，NP)編碼基因中的高度保守序列作為siRNA靶序列，將其分別或同時克隆入表達載體，在馬丁達比狗腎細胞中，觀察誘導PA或NP基因沉寂情況，以期具有更高的抑制效能，為預防與治療流感尋找一種有效的措施.

1材料和方法

材料pEGFP和pGenesil1載體由武漢晶賽生物技術有限公司提供.限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司.連接酶、DNAMarker由Takara公司提供.轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen.兔抗人NP抗體購于晶美生物工程有限公司，βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG購自Sigma公司.

方法選用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004(H5N1亞型，分離).將病毒接種于10d雞胚尿囊腔中，置于37℃的孵箱中，于病毒接種后的48h收獲尿囊液，凍融、離心后分裝貯存于-70℃?zhèn)溆?測定其空斑形成單位及感染復數(shù).據(jù)文獻［6］，結(jié)合siRNA序列設計原則，確定PA2087和NP1496各19個單核苷酸作RNA干擾靶序列.正義鏈：5＇gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataagatccttttttgaattca3＇，反義鏈：3＇gcctagaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5＇;PA2087，正義鏈：5＇gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3＇，反義鏈：3＇gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5＇，上述兩序列的5＇端和3＇端分別引入BamHI和HindIII的酶切序列，也在HindIII位點內(nèi)側(cè)分別引入EcoRI和SacI的酶切位點，以便將兩個RNA干擾序列以串連的方式克隆入同一個載體中的兩個U6啟動子后，即U6promoterNPU6promoterPA，這樣可同時產(chǎn)生兩個RNA干擾序列.等量的正反義寡核苷酸混合、退火后分別插入經(jīng)BamHI和HindIII線性化的載體pEGFP和pGenesil1中，得到重組載體pEGFP/NP和pGenesil/PA.兩載體經(jīng)SacI和SalI雙酶切后，分別回收載體與片段并連接，構(gòu)建成新的重組子pEGFP/NP＋PA.實驗中為了排除siRNA本身的影響，設計了一個與流感病毒基因組序列無關的HK序列作為對照，寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.MDCK細胞株常規(guī)培養(yǎng)于含有100mL/LFCS,2mol/L谷胺酰胺、105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，每2～3d進行細胞傳代.轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM2000，根據(jù)說明書進行操作.分為pEGFP/NP,pGenesil/PA,pEGFP/NP+PA,pEGFP/HK和未轉(zhuǎn)染對照組進行實驗.轉(zhuǎn)染后6h更換正常培養(yǎng)基，12h后在熒光顯微鏡與流式細胞儀下觀察EGFP的表達，計算轉(zhuǎn)染效率.細胞轉(zhuǎn)染12h后，經(jīng)H5N1感染72h，g/L的胰酶消化，收集細胞，提取RNA.在RTPCR反應體系中逆轉(zhuǎn)錄引物采用Uni12和PolyT進行，PCR擴增的三對引物,第1對是內(nèi)源性對照βactin(336～635bp)，第2對與第3對是被沉寂的目的基因引物，即H5N1/NP(901～1500bp)和H5N1/PA(708～2207bp).GeneTools軟件判定靶基因的沉寂程度.收集轉(zhuǎn)染并經(jīng)感染的細胞，提取總蛋白，紫外分光光度計法進行蛋白質(zhì)定量.50μg蛋白質(zhì)進行120mL/LSDSPAGE，之后轉(zhuǎn)至NC膜上.NP抗體的濃度為1∶400，二抗為1∶3000，辣根過氧化物酶/LumiGLO化學發(fā)光法進行Western檢測.GeneTools軟件判定靶蛋白表達的沉寂程度.轉(zhuǎn)染12h后，去除培養(yǎng)基，以MOI為的劑量感染H5N1病毒，于35℃,50mL/LCO2孵箱中吸附1h后，加入5mL的感染性培養(yǎng)基于37℃,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)，于不同的時間測定細胞培養(yǎng)上清的血凝值.病毒抑制率采用公式［1(HAtest/HAcontrol)］×100進行計算［11］.

2結(jié)果

siRNA表達載體及其多克隆位點如圖1A和圖1B所示.重組載體pEGFP/NP＋PA如圖1C所示，兩個小發(fā)夾RNA的產(chǎn)生見圖2.pEGFP/NP采用EcoRI進行酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生一個大約400bp的片段.pGenesil/PA采用SacI進行單酶切鑒定，如圖3A.pEGFP/NP＋PA重組體采用BamHI酶切鑒定，酶切后可得到約400bp的片段，與預期結(jié)果相同(圖3B).熒光顯微鏡檢測表明，除對照組呈陰性外，pEGFP/HK,pEGFP/NP，/PA或pEGFP/NP+PA實驗組在轉(zhuǎn)染12h后均可見熒光蛋白表達，48～72h達高峰.流式細胞儀分析，EGFP陽性細胞達%.

A:pEGFP;B:pGenesil;C:pEGFP/NP＋PA.

圖1siRNA表達質(zhì)粒圖譜

轉(zhuǎn)染細胞中NP和PAmRNA的檢測各實驗組βactin基因片段條帶的亮度強弱相似，表明模板量一致.未轉(zhuǎn)染組與pEGFP/HK組細胞在病毒感染后，NP或PA基因擴增帶亮度較強，而pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA組的NP或/和PA基因擴增帶亮度明顯減弱，表明3種重組質(zhì)粒在mRNA水平上抑制病毒NP或/和PA基因的轉(zhuǎn)錄，pEGFP/HK對靶基因的mRNA沒有抑制作用，提示siRNA抑制靶基因轉(zhuǎn)錄有特異性.以對照組NP或PA擴增條帶為標準(亮度定為100)，GeneTools軟件分析結(jié)果顯示，pEGFP/HK組的NP或PA是對照組的%和100%；pEGFP/NP組NP,PA基因擴增條帶分別是對照組的%和%；/PA組NP,PA基因的擴增條帶分別是對照組的%和%;pEGFP/NP+PA組的NP或PA擴增條帶強度分別是對照組的%和%(圖5).

轉(zhuǎn)染細胞中NP蛋白的檢測對照組與pEGFP/HK組的NP蛋白雜交帶明顯強于pEGFP/NP組或pEGFP/NP+PA組，其中pEGFP/NP+PA組的NP雜交帶更弱.GeneTools軟件分析結(jié)果所示，以對照組的NP蛋白帶為標準，pEGFP/HK,pEGFP/NP或pEGFP/NP+PA組的條帶強度分別是對照組的%,%和%,表明干擾序列可以特異地抑制流感病毒蛋白的表達.

A：表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后，形成的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)；B：shRNA經(jīng)dicer酶剪切后，特異性地結(jié)合到流感病毒基因組NA或PA節(jié)段上.

圖2流感病毒NP或PA的shRNA

或PA特異性siRNA抑制流感病毒在MDCK細胞的增殖各實驗組于轉(zhuǎn)染12h后分別利用MOI為的H5N1流感病毒攻擊，于感染后不同時間測得的HA值(表1).可以看出，對照組和pEGFP/HK組的病毒滴度隨著病毒作用的時間延長而增高，在48～72h達到高峰，HA值均達到512，表明非特異的siRNA不會影響病毒的增殖.pEGFP/NP或/PA組在病毒滴度的高峰時間，即48～72h的HA值僅為64和128，以后隨時間的延長并沒有升高，表明pEGFP/NP或/PA在一定程度上能夠抑制流感病毒在MDCK細胞中的增殖，且pEGFP/NP的抑病毒能力好于/PA.在pEGFP/NP+PA組培養(yǎng)上清中，隨病毒感染時間的延長未見到HA值明顯升高，感染72h后HA值僅為4.pEGFP/NP，/PA和pEGFP/NP+PA三者抑制病毒增值率分別為87%，75%和%.

A：pEGFP/NP和/PA的酶切結(jié)果.M：標準分子量DL2000;1:pEGFP/NP;2:pEGFP/NP經(jīng)EcoRI酶切后可以獲得一個約400bp的片段;3:/PA;4:/PA經(jīng)SacI的酶切結(jié)果.B:pEGFP/NP+PA的酶切鑒定.M：標準分子量DL2000;1,3:不同克隆的pEGFP/NP+PA;2,4:pEGFP/NP+PA經(jīng)BamHI酶切后，可以獲得400bp的片段.

圖3siRNA表達質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶鑒定

A:pEGFP/NP轉(zhuǎn)染MDCK細胞×100;B:pEGFP/NP+PA轉(zhuǎn)染MDCK細胞×400;C:陰性對照×100.

圖4熒光顯微鏡檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

βactin作為內(nèi)參照，1:pEGFP/NP+PA;2:/PA;3:pEGFP/NP;4:pEGFP/HK;5:感染的MDCK細胞;6:MDCK細胞;M:標準分子量DL2000.

圖5半定量RTPCR法分析NP和PAmRNA的沉寂結(jié)果

1:H5N1感染的MDCK;2:pEGFP/NP組;3:pEGFP/NP+PA組;4:pEGFP/HK組.

圖6WesternBlot分析NP和PA蛋白表達抑制情況

表1特異性siRNA對流感病毒增殖情況的影響

HK:siRNA陰性對照序列;NP:流感病毒核蛋白;PA:流感病毒RNA聚合酶酸性蛋白亞單位.

3討論

流感病毒是節(jié)段性、單股負鏈RNA病毒，基因組RNA在復制過程中高達10-4的錯配率及機體免疫和藥物治療的選擇壓力，使病毒不斷地變異與進化［7］，是造成流感流行與爆發(fā)的重要因素.流感病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、復制依賴于NP和3種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRps)，即PB1，PB2和PA共同組成的核糖核蛋白酶復合體.NP與其他聚合酶蛋白共同調(diào)節(jié)病毒RNA轉(zhuǎn)錄與合成間的轉(zhuǎn)換NP也可以防止RNA合成中斷，有利于RNA鏈的延伸［8］.PA是RNA依賴的RNA聚合酶亞單位之一，是RNA復制的基礎.如果PA的含量降低，RNA片段的轉(zhuǎn)錄與復制可能會被阻斷，流感病毒的增殖則會受到抑制［9］.由此看來，NP或PA基因是阻斷流感病毒增殖的理想靶基因片段.RNAi是目前最有效的基因沉寂技術.新近的研究表明，siRNA可通過沉寂同源的病毒基因或沉寂與病毒復制有關的宿主基因，使病毒在感染的不同時期受到抑制，且很少出現(xiàn)副作用，是一個潛在的、強有力的抗病毒武器，在抗HIV的實驗研究中已經(jīng)顯示出較好的作用，表明RNA沉寂用于抗病毒治療有良好的前景.

為了更有效地抑制流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復制，我們構(gòu)建了干擾流感病毒NP或/和PA的siRNA表達質(zhì)粒，避免了同一細胞轉(zhuǎn)染多個質(zhì)粒難度大、效率低的困難.結(jié)果表明，三種重組質(zhì)粒pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA都能不同程度地抑制目的基因NP或/和PA的RNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達，而pEGFP/HK對NP或PA基因無抑制作用，提示pEGFP/NP,/PA和pEGFP/NP+PA抑制目的基因的特異性.更為重要的是，HA結(jié)果表明，在分別轉(zhuǎn)染pEGFP/NP,/PA或pEGFP/NP+PA的MDCK細胞中，流感病毒的增殖受到了不同程度的抑制，以pEGFP/NP+PA的效果更佳.本研究為進一步體內(nèi)實驗奠定了基礎.

【參考文獻】

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