正交試驗(yàn)法優(yōu)選前列寧顆粒劑的提取工藝

正交試驗(yàn)法優(yōu)選前列寧顆粒劑的提取工藝【摘要】：［目的］篩選和優(yōu)化前列寧顆粒劑提取工藝。［方法］采用正交設(shè)計(jì)法，以水醇兩組提取物中浸膏得率、有效成分分別為大黃酸和黃芪甲苷提取率為指標(biāo)，確定提取參數(shù)。［結(jié)果］確定黃芪等藥組水提工藝為10倍量水，煎煮3次，每次；大黃等藥醇提組工藝為6倍量60%乙醇，提取2次，分別為、。［結(jié)論］前列寧顆粒劑提取工藝穩(wěn)定，可行。

【關(guān)鍵詞】前列寧顆粒劑；大黃酸；黃芪甲苷；提取工藝；正交設(shè)計(jì)

Abstract:［Objective］TofilterandoptimizeextractivetechnologyofQianlieninggranules.［Methods］TheoptimizationextractivetechnologyofQianlieninggranuleswasinvestigatedusingorthogonaldesignwiththeavailabilitycomponentextractingfromthedrugastheindex.［Results］TheoptimalconditionfortheextractionofRadixAstragaligroupwas10foldsamountofwater，3times,hourseachoptimalconditionfortheextractionofRheumofficinalwas6foldsamountof60%alcohol,2times,twohoursandhourseachtime.［Conclusion］Theoptimizedextractivetechnologyisscientificandefficient.

Keywords：QianlieningGranules；Rhein；AstragalosideIV；extractivetechnology；orthogonaldesign

前列寧顆粒由酒大黃、黃芪、牛膝、菟絲子等多味中藥組成，為我院中西醫(yī)結(jié)合系洪振豐教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、活血化瘀、益氣補(bǔ)腎之功效，用于治療慢性前列腺增生及前列腺炎等癥，療效顯著［1］。為方便臨床用藥和患者攜帶，實(shí)驗(yàn)對(duì)組方成分進(jìn)行分析，根據(jù)各味藥材所含成分的理化性質(zhì)，擬分水溶和醇溶兩組提取。其中黃芪、菟絲子等藥采用水煎煮提取，酒大黃、牛膝等藥采用醇提，對(duì)其提取工藝采用正交實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行研究，以確定最佳提取工藝，使制劑工藝更加合理。

1儀器與試藥

美國(guó)Waters600E高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器，四元泵，在線真空脫氣機(jī)，Millennium32色譜工作站；SartoiousBT25S型電子分析天平；恒溫干燥箱(北京市朝陽(yáng)區(qū)來(lái)廣營(yíng)醫(yī)療器械廠)；DKS24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

酒大黃、黃芪等實(shí)驗(yàn)藥材均購(gòu)自福建同春藥業(yè)有限公司，經(jīng)我院藥學(xué)系鑒定符合2005版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定；大黃酸對(duì)照品；黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110781-200512)；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

水煎煮組正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)法對(duì)黃芪、菟絲子等藥組水煎液提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2］，以提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、加水量(C)為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選，以浸膏得率和黃芪甲苷含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。表1水煎煮組的因素水平表

浸膏得率測(cè)定：精密吸取母液20ml，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃下干燥3h，迅速取出，放入干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定，計(jì)算出膏率。

水煎液中黃芪甲苷的測(cè)定［3］

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(38:62)為流動(dòng)相；流速為/min。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)。此色譜條件下，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算，應(yīng)不得低于4000。

對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品，置于10ml容量瓶中，加入甲醇定容，制成/ml的溶液，即得。

供試品溶液的制備

按正交表?xiàng)l件提取，合并提取液，濾過(guò)，濾液濃縮至1:1，加乙醇使醇濃度達(dá)75％，低溫靜置24h，取上清液減壓回收乙醇，濃縮定容于100ml量瓶，搖勻。分別精密量取，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌3次，每次20ml，正丁醇提取液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芤翰⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取對(duì)照品溶液2，4，6，8，10μL，分別注人高效液相色譜儀，依法測(cè)定?；貧w方程為Y=+，r=。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量線性范圍為～μg。

精密度試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算精密度，結(jié)果黃芪甲苷峰面積的RSD為％(n=5)。

重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品，配制3種濃度，照含量測(cè)定項(xiàng)下方法每個(gè)濃度測(cè)定3次，結(jié)果RSD為％、％、％，表明重現(xiàn)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在0，4，16，24，48h分別進(jìn)樣5次，依法分別測(cè)定黃芪甲苷蜂面積值。結(jié)果％，表明本品在48h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一批樣品，各精密加入黃芪甲苷對(duì)照品適量，按項(xiàng)下方法制備供試液，依法測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，得平均回收率為％，RSD＝％。

水煎煮組最佳工藝確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。按下列公式計(jì)算綜合評(píng)分值:出膏率加權(quán)評(píng)分(y1)＝(出膏率-12)/×100；黃芪甲苷含量加權(quán)評(píng)分(y2)=(測(cè)定量-)/×100。綜合評(píng)分=/2。表2水煎煮組正交試驗(yàn)結(jié)果表3水提工藝方差分析表

由表2可見(jiàn)，3個(gè)因素的級(jí)差大小順序?yàn)锳CB，提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響最大，加水量影響較大，提取時(shí)間影響最小。由表4可見(jiàn)，因素A(提取次數(shù))、因素C(加水量)有顯著性，因素B(提取時(shí)間)無(wú)顯著性。故最佳工藝為A3B1C3，即用10倍量水，提取3次，每次。按優(yōu)選的最佳工藝提取3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可知，三批樣品出膏率分別為％、％、％；黃芪甲苷含量分別為、、/g。驗(yàn)證結(jié)果表明工藝基本穩(wěn)定可行。

醇提組正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果［4］，采用正交試驗(yàn)法。以浸膏得率和大黃酸的含量為考察指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度(A)、醇用量(B)、提取時(shí)間(C)3個(gè)試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)選，并以浸膏得率和大黃酸含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表4。表4醇提組的因素水平表

大黃酸含量測(cè)定

色譜條件

填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，色譜柱為SHIMADZUC18色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-％磷酸溶液(85∶15)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為/min。理論塔板數(shù)按大黃酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥2h后的大黃酸對(duì)照品，置于25ml量瓶中，加甲醇至刻度，得含大黃酸/ml的對(duì)照品溶液，備用。

線性關(guān)系考察

分別精密量取大黃酸對(duì)照品溶液、、、、，置于10ml量瓶中，加甲醇至刻度，分別進(jìn)樣5μl。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=+(r=)。結(jié)果表明，大黃酸進(jìn)樣量在～μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

供試品溶液的制備

用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，稱取處方量的藥材，按設(shè)定方案進(jìn)行回流，收集回流提取液，定容至200ml，精密量取50ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，置干燥器中冷卻，迅速稱量。精密量取已定容樣品液50ml，水浴蒸干，加5mol/L。硫酸溶液20mL，置水浴加熱1h，立即冷卻，加氯仿提取3次(30、30、20ml)，合并氯仿液，加水洗滌2次(20、20ml)，棄去水層，氯仿液水浴蒸干，殘留物加甲醇定容至5ml，即得。

含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液5μl、供試品溶液10μl，分別注入液相色譜儀，按“”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。高效液相色譜見(jiàn)圖1。

精密度試驗(yàn)

精密量取“”項(xiàng)下大黃酸對(duì)照品溶液5μl，重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積。結(jié)果，峰面積RSD=％，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“”項(xiàng)下的供試品溶液。分別于0，4，16，24，48h時(shí)按“”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果：峰面積RSD=％。表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

醇提組最佳工藝確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。按下列公式計(jì)算評(píng)分值：出膏率加權(quán)評(píng)分(y1)＝(出膏率-13)/×100；黃芪甲苷含量加權(quán)評(píng)分(y2)=(測(cè)定量-5)/×100。綜合評(píng)分=/2。表5醇提組的正交試驗(yàn)結(jié)果表6方差分析結(jié)果

由表5可見(jiàn)，3個(gè)因素的級(jí)差大小順序?yàn)镃AB，提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響最大，醇濃度影響較大，醇用量影響最小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳工藝為A2B2C3。由表6可見(jiàn)，提取時(shí)間有顯著性，醇濃度、醇用量無(wú)顯著性?？紤]生產(chǎn)成本，確定A1B1C3為最佳工藝，即用6倍量60％醇溶液，提取2次，分別為、。按優(yōu)選的最佳工藝提取3批樣品進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，可知，三批樣品出膏率分別為％、％、％；大黃酸含量分別為、、/g。驗(yàn)證結(jié)果表明工藝基本穩(wěn)定可行。

3討論

驗(yàn)方中大黃取其解毒泄下之功，以清體內(nèi)熱毒，使?jié)駸嵊上露ィ蝗∑浠钛铕鲋?，使血行通暢，瘀血得解；一藥兩用，為君藥。而其中大黃酸具有抗菌抗炎作用，故醇提組選擇以大黃酸作為含量測(cè)定指標(biāo)。黃芪取其補(bǔ)氣之功而治前列腺增生日久氣虛之候，而其利水之功又可助它藥以泄?jié)瘢仕峤M以黃芪甲苷作為指標(biāo)成分。黃芪等藥味中的活性成分在水中有較好的溶解度，故考慮用傳統(tǒng)的水煎煮提取。大黃、牛膝等醇提組藥物中有效成分在醇溶液中溶解度較大。

前列寧顆粒為復(fù)方制劑，成分復(fù)雜。試驗(yàn)選擇以浸膏得率和相應(yīng)的含量測(cè)定為指標(biāo)，可綜合評(píng)價(jià)工藝的合理性。采用正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，確定的提取工藝簡(jiǎn)便、科學(xué)，符合生產(chǎn)要求。

【參考文獻(xiàn)】

［1］周建衡，洪