纖維素酶活力的測定

實驗二十纖維素陋活力的測定一、目的學(xué)習(xí)和掌握3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定纖維素酹活力的原理和方法，了解纖維素酶的作用特性。二、原理纖維素酶是一種多組分酶，包括C酶、C酶和|?-葡萄糖昔酶三種主要組分。其中C1X1施的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素?，C酣的作用是將無定形纖維素繼續(xù)水解成纖維寡糖，I?-葡萄糖甘能的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。纖維素前水解纖維素產(chǎn)生的纖維二糖、葡萄糖等還原糖能將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原，生成棕紅色的氨基化合物，在540nm波長處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強度呈?比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。三、實驗材料、主要儀器和試劑.實驗材料.實驗材料（1）纖維素酶制劑（2）新華定量濾紙（3）脫脂棉花（4）裝甲基纖維素鈉（5）水楊酸苗.主要儀器500mg50mg/份450mg/份4(CMC)510mg500mg（1）722型或其他型號的可見分光光度計（2）恒溫水浴2臺（3）沸水浴鍋（4）電爐子（5）剪刀（6）萬分之一分析天平（7）恒溫干燥箱（8）冰箱（9）試管架（10）膠頭滴管（11）具塞刻度試管 20mL24（12）移液管或加液器 0.5mL3；2mL7（13）容量瓶100mL6；1000mL3（14）量筒50mL2；100mLl；500mLl（15）燒杯100mL6；500mL3；1000mLl3.試劑（均為分析純）（1）濃度為Img/mL的葡萄糖標(biāo)準液將葡萄糖在恒溫干燥箱中105C下干燥至恒重，準確稱取lOOrng于100mL小燒杯中，用少量蒸鐳水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸儲水定容至100mL,充分混勻。4℃冰箱中保存（可用12?15天）。3,5-二硝基水楊酸（DNS）溶液準確稱取DNS6.3g于500mL大燒杯中，用少量蒸鐳水溶解后，加入2moi/LNaOH溶液262mL,再加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉（CHOKNa!4HO,MW=282.22）的熱4462水溶液中，再加5g結(jié)晶酚(CHOH,MW=94.U)和5g無水亞硫酸鈉(NaSO,MW=126.04),6523攪拌溶解，冷卻后移入1000mL容量瓶中用蒸鐳水定容至1000mL,充分混勻。貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液A液(O.lmol/L檸檬酸溶液)：準確稱取CHO!HO(MW=210.14)21.014g于500mL6872大燒杯中，用少量蒸譙水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸鐳水定容至1000mL,充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。B液(0.1moI/L檸檬酸鈉溶液)：準確稱取NaCHO!2HO(MW=294.12)29.412g36572于500mL大燒杯中，用少量蒸儲水溶解后，移入1000mL容量瓶中，然后用蒸鏘水定容至1000mL,充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液27.12mL,B液22.88mL,充分混勻后移入100mL容量瓶中用蒸傭水定容至100mL,充分混勻，即為0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于測定濾紙能活力。0.05mol/LpH5.0的檸檬酸緩沖液取上述A液20.5mL,B液29.5mL,充分混勻后移入100mL容量瓶中用蒸儲水定容至100mL,充分混勻。即為的檸檬酸緩沖液。4c冰箱中保存?zhèn)溆?。用于測定C酶活力。0.51%撥甲基纖維素鈉(CMC)溶液精確稱取0.51gCMC于100mL小燒杯中，加入適量0.05mol/LpH5.0的檸檬酸緩沖液，加熱溶解后移入100mL容量瓶中并用0.05mol/LpH5.0的檸檬酸緩沖液定容至100mL，用前充分搖勻。4c冰箱中保存?zhèn)溆?，用于測定C酶活力。0.5%水楊酸甘溶液準確稱取0.5g水楊酸甘于100mL小燒杯中，用少量0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.05mol/LpH4.5的檸檬酸緩沖液定容至100mL,充分混勻。4c冰箱中保存?zhèn)溆?，用于測定|?-葡萄糖甘酸活力。(7)纖維素酶液的配制準確稱取纖維素酶制劑500mg于100mL小燒杯中，用少量蒸飾水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸儲水定容至100mL,此酶液的濃度為5mg/mL,4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。四、操作方法和步驟葡萄糖(G)標(biāo)準曲線的制作取8支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后按表1加入標(biāo)準葡萄糖(G)溶液和蒸儲水，配制成?系列不同濃度的偵萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸儲水定容至20mL,充分混勻。在540nm波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調(diào)零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出葡萄糖標(biāo)準曲線。表I望萄魂標(biāo)準或稅制作X12345678葡若翰標(biāo)液（mL）00.20.40.60.81.0121.4修館次（mL）2.01.8161.41.21.00.80.6句曲翰含量（mg；00.20.40.60.81.0121.4濾紙酶活力的測定取4支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后各加入0.5mL酣液和L5mLO.O5mol/LH4.5的檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入L5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在50℃水浴中預(yù)熱5?lOmin,再各加入濾紙條50mg（新華定量濾紙，約1cm!6cm）,50℃水浴中保溫lh后取出立即向2、3、4號試管中各加入.5mLDNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸儲水定容至0mL,充分混勻.以1號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540nm波長下測定2、3、4號試管液的光密度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3個重復(fù)光密度的平均值，在標(biāo)準曲線上查出對應(yīng)的葡萄糖含量，按下式計算出濾紙酶活力（U/g）。在上述條件下，每小時由底物生成mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。. =董蕾糖含量（mg）-稱液定容總體積（mL）xs.56.小一刀（g= 反應(yīng)液中/液加入量（mL）x憚品重（g）x時間仆）式中:5.56為ling葡萄糖的molSo（1000/180=5.56）C酹活力的測定1將5mg/mL的原醐液稀釋10?15倍后用于測定C酶活力，以脫脂棉為底物。1取4支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后各加入50mg脫脂棉，加入1.5mL0.05MH5.0的檸檬酸緩沖液，并向1號試管中加入1.5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在45℃水浴中預(yù)熱5?lOmin,再各加入適當(dāng)稀釋后的陋液0.5mL,45℃水浴中保溫24h。取出后立即向2、3、4號試管中各加入1.5mLDNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸儲水定容至20mL,充分混勻。以1號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540nm波長下測定2、3、4號試管液的光密度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3個重復(fù)光密度的平均值，在標(biāo)準曲線上查出對應(yīng)的葡萄糖含量，按下式計算出C酶活力（U/g）。在上述條件下反應(yīng)24h,由底物生成葡萄糖所需的酶量定義為一個前活力單位（U）。.，t■>■含■（mg）x酸液定容苣體積（mL）x稀釋管數(shù)x5.56*24C. 反應(yīng)液中夠液加入世（mL）x樣品量（g）*時間（h）式中：24為酶活力定義中的24hoC酶活力的測定將5mg/mL的原酶液稀釋5倍后用于測定C酶活力，以CMC為底物。取4支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后各加入1.5mLO.51%CMC檸檬酸緩沖液，并向1號試管中加入1.5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在50C水浴中預(yù)熱5?再各加入稀釋5倍后的酶液0.5mL,50℃水浴中保溫30min后取出，立即向2、3、4號試管中各加入1.5mLDNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸儲水定容至20mL,充分混勻。以1號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540nm波長下測定2、3、4號試管液的光密度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3個重復(fù)光密度的平均值，在標(biāo)準曲線上查出對應(yīng)的葡萄糖含量，按下式計算出C能活力（U/g）。在上述條件下，每小時由底物生成葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。._丁蕊?含量（mg）“解液定容總體積（mL）X＞驛倍數(shù)X5,6Cx" 反應(yīng)液中酹液加入量（mL）x樣品童（g）x時間（h）|?-飾萄糖甘酶活力的測定取4支洗凈烘干的20mL具塞刻度試管，編號后各加入1.5mL0.5%水楊酸甘檸檬酸緩沖液，并向1號試管中加入1.5mLDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在50C水浴中預(yù)熱5?lOmin,再各加入酶液0.5mL,50c水浴中保溫30min,取出后立即向2、3、4號試管中各加入1.5mLDNS溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min,取出冷卻后用蒸鏘水定容至20mL,充分混勻。以1號試管溶液為空白對照調(diào)零點，在540nm波長下測定2、3、4號試管液的光密度值并記錄結(jié)果。根據(jù)3個重復(fù)光密度的平均值，在標(biāo)準曲線上查出對應(yīng)的葡萄糖含量，按下式計算出I?-葡萄糖甘酶活力（U/g）。在上述條件下，每小時由底物生成mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。他/」含」（mg）X繇液定容啟詠積（mL1*5.56'優(yōu)估"小九',?一反應(yīng)液中醯液加入量（mL）x樣品莖（g）x時間（h）玉、結(jié)輿計算1.煢蕾嘴（G）標(biāo)準曲線的制作（表2）R2標(biāo)準小娥測定數(shù)先列及管號 12345678便荀黝含量（mg） 0020.40.60.81.01.21.4光客文（ODyg）根據(jù)表中數(shù)值,以董萄糠（G）含量（mg）為橫坐標(biāo),以對應(yīng)的光年變值為縱空標(biāo).在色標(biāo)紙上繪制出董狀精標(biāo)準由俵，并在坐標(biāo)紙的右上角寫上實醛題目、時間、實驗人,.滋豕酪活力的測定結(jié)果計算（表3）及3法紙快活力的測定數(shù)據(jù)元及管號1234三管平均任光容度（ODnm）0錦萄翰含量（mg>0根據(jù)潴紙瓶活力公式，計算臼逋水誨活力（Ug）i謔紙夠活力（fg）=就端糖含量(mg)x】oo(mL)x5.56

謔紙夠活力（fg）=.C；夠活力的測定結(jié)果計算（表4）及4C,總活力的洌定數(shù)據(jù)丹農(nóng)管號 I 234三管平均企尤秀度任 0他電糖含量（mg） 0根據(jù)a牌活力公式,計算出c*活力（u/g）?一——（mg）xlop（mL），4莽倍數(shù)x5.56x240.5(mL)*0.5(g)?24(h)4.Cx需活力的測定結(jié)輿計算管號I 234三管平均位產(chǎn)容度假0能的粉含量(mg)0根據(jù)0質(zhì)活力公式,計算出Q點活力(U/g),Cx的活力(U/g)=竟筱黨含量(mg)x】00(mL)>5(倍)Cx的活力(U/g)=工；工董部瑞甘梆活力的測定結(jié)果計算管號I234三管平均值乃再度位0牝瞥觸含量(mg>0根據(jù)區(qū)筮微野甘夠活力公式，計算出a筮能摒甘酸活力(i；g)i，:鐲糖甘黑活力(Lg)=黃優(yōu)野