分子實驗技術

分子實驗技術1第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)、重組DNA技術-基因工程第二節(jié)、分子雜交及相關技術第三節(jié)、聚合酶鏈反應的原理和應用第四節(jié)、基因定位的常用方法2第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日分子生物學技術70年代以來,分子生物學技術迅速發(fā)展起來,使人們有可能進行人類基因組及單個基因的結構研究,分析其功能特征,了解其變化規(guī)律。分子生物學技術為揭示人類遺傳病的本質起著重要作用。下面就一些分子生物學技術予以介紹。3第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日194619501955196019651970197519801985199019951944DNA是遺傳物質1949Hbs貧血1953雙螺旋1956HbsGlu-Val1966遺傳密碼第一個R酶1972重組質粒1975DNA雜交1977DNA測序1981轉G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一個基因治療1995細菌G組序列1996酵母基因組序列現(xiàn)代分子遺傳學發(fā)展重要事件4第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日

第一節(jié)重組DNA技術-基因工程

重組DNA技術是現(xiàn)代分子生物技術發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術。重組DNA技術（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運載體重組，轉移至另一細胞或生物體內，以達到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術的發(fā)展和應用，關鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應用。

5第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日一、限制酶

限制性內切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術刀”）。發(fā)現(xiàn)于原核生物體內，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。6第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日1、限制酶的命名

根據(jù)其來源命名。如：

屬名菌株名

EcoRI

種名編號EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個限制酶。7第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2、限制酶識別序列和切割形成

每種限制酶能識別和切割的通常4～8個核苷酸序列，稱為限制性位點或切點。

如：HareⅢ5’-GGCC-3’

BamHI5’-GGATCC-3`

平末端(bluntend)對稱軸切，連接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交錯切。8第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日9第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日部分常用限制酶及切點10第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日互補末端連接11第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段

可有三種方式：

1)用同一種限制酶切割；2)用識別相同靶序列的不同限制酶切割；3)用識別不同靶序列但可產(chǎn)生一致的粘性末端的限制酶切割。12第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日3、特點：

根據(jù)上述限制酶的特點，在基因工程和基因診斷中的重要用途：1)不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質粒DNA等。2)用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶切位點。3)Gene突變改變酶切位點的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應用于限制性片段多態(tài)性分析。13第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日二、基因運載體及其選擇

載體（Vector）:將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。14第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日載體具以下特征：1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進入宿主細胞并在其中增殖；2)有多種限制酶切點，每種限制酶最好只有單一切點；3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復制能力，并有可選擇的標記基因（如，抗藥基因）。常用的載體有：質粒，λ噬菌體，粘粒，BAC，YAC，PI等。15第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日（一）.質粒plasmid

Plasmid獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

PBR322

大腸桿菌

pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革蘭氏陰性菌

pc194

scp12

真核生物-酵母質粒

16第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日常用的質粒如pUC19，多連接子MCS。插入外源基因片段長度約10kb。將外源基因插入到MCS中，隨質粒的表達而表達，增殖而擴增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性喪失而不顯蘭色-白色菌落。如果不插入外源基因，則產(chǎn)生蘭色。從而篩選陽性菌落。

EcoRIHindIIIOri復制起點LacZAPRpUC1917第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日

（二）.λ-噬菌體(λphage)是一種可在體外包裝的細菌病毒,可高效感染大腸桿菌.λ-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子,全長約50kb,每條鏈各帶12bp長的單鏈互補末端-粘末端(COS序列)。進入宿主細胞后不久，COS序列堿基配對環(huán)化。改建后的λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如：18第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日1、置換λ載體–

溶解途徑載體和外源DNA整合到宿主菌DNA中?？煽寺?3kb的外源DNA。2、插入λ載體–

裂解途徑

DNA在宿主細胞中復制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體?？煽寺?kb的cDNA。19第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日裂解途徑20第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日（三）.粘粒(cosmidvector)

（30～40kb）

是將質粒和λ噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復制起點和cos末端。全長8kb。大片段外源DNA插入后，在體外包裝進而被克隆?？砂b30～45kb長的DNA片段，多用于基因文庫構建。

21第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日(四)大片段DNA克隆載體

人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多單個基因也相當大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構建的一些載體：BAC，PI，YAC等。22第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日1、細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

優(yōu)點：能攜帶大片段DNA，約300kb。在每個細胞中，一個載體分子能繁殖多個拷貝，高產(chǎn)DNA。缺點：會出現(xiàn)插入片段在結構上的不穩(wěn)定，導致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點，人們采用低拷貝數(shù)復制子載體，如，Ecoli中的F因子。此質粒含有2種基因（partA,partB）。每個Ecoli能接受>300kbDNA片段。23第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2、噬菌體PI載體和PAC

PI噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質殼。內含相當大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于PI殼內。PI進入宿主細胞后環(huán)化，擴增。1994年，有人將PI和F因子克隆結合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。24第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日3、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）適用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。25第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日YAC的主要功能成份有三：

1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護染色體末端免受核酸酶的侵襲。3）自主復制序列（ARS）元件：是染色體自主復制的復制起點。構建YAC需要4個短序列：2個端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導入酵母細胞克隆。26第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日三、DNA重組與分子克隆化

為獲得所需的基因或特異序列，需從細胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，并用適當方法在宿主細胞中表達，擴增得到大量相同的DNA片段，稱為DNA克隆，亦稱分子克隆。27第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日

基本原理與過程：

1、分離純化目的基因

2、目的基因+vector=重組DNA分子

3、重組DNA分子導入受體細胞，并在其內增殖。

4、篩選含有重組DNA的細胞——細胞克隆（cellclone），將轉化的細胞置于瓊脂表面，以刺激細胞克隆生長，這些細胞是由單個細胞形成的遺傳相同的細胞群體，故稱細胞克隆。再將每個克隆移至液體培養(yǎng)基中進行擴增。

5、分離重組DNA克?。杭词斋@擴增的培養(yǎng)細胞，并選擇分離重組DNA。28第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日分離純化目的基因

目的基因+vector=重組DNA分子

29第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日重組DNA和分子克隆

30第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日重組DNA和分子克隆的幾種方法：

（依目的基因的來源）

1、從基因組中分離目的基因在細胞中克隆

2、由特定mRNA逆轉錄合成cDNA后再進行克隆

3、化學合成目的基因進行克隆

4、PCR體外擴增目的片段進行克隆31第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日從基因組中分離目的基因在細胞中克隆

32第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日篩選含有重組DNA的細胞——細胞克?。╟ellclone）

33第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日篩查含有目的基因的細胞克隆34第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日四、目的基因表達

上述細胞的克隆系統(tǒng)可直接導入的目基因擴增，獲得足夠量的目的基因來進行結構與功能的研究。重組DNA技術的另一目的是獲得基因重組后的產(chǎn)物——RNA，蛋白質。就是將目的基因與表達載體重組，導入宿主細胞進而表達出相應的基因產(chǎn)物（蛋白）。如胰島素，干擾素；生產(chǎn)疫苗的抗原和特異的抗體等。此類克隆系統(tǒng)稱為表達克隆。（expressioncloning）.35第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日目的基因表達

36第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日（一）．真核細胞的基因在原核細胞

（細菌）中表達

原核細胞中缺乏真核基因表達裝置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表達。通常采用大腸桿菌為宿主。真核多肽的表達要求：

1）適當?shù)腸DNA（完整的編碼序列）；

2）適當?shù)谋磉_載體，提供特定多肽信息；

3）外部進行表達調控，表達系統(tǒng)設計有啟動子。

產(chǎn)物特征：

1）真核細胞的蛋白由于不能羥基化而不穩(wěn)定；

2）活性受限或無活性。37第三十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日(二)、真核細胞基因在真核細胞中表達

真核宿主細胞提供一個相似但又不相同的環(huán)境。常采用酵母或昆蟲細胞作為宿主。應用于真核細胞蛋白質的大量制備，研究特定基因的表達。產(chǎn)物翻譯后羥基化，羧基化等，有加強蛋白的穩(wěn)定和功能活性。38第三十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日