基因工程的理論基礎與基本技術(shù)

基因工程的理論基礎與基本技術(shù)第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第二章基因工程的理論基礎與基本技術(shù)

第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)基因工程的理論基礎第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（一）原核生物的基因結(jié)構(gòu)特點1.操縱子結(jié)構(gòu)

操縱子（Operon），由幾個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列而組成的一個基因表達的協(xié)同單位（coordinatedunite），稱為操縱子。

一基因結(jié)構(gòu)特點調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因結(jié)構(gòu)基因第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日大腸桿菌乳糖操縱子

第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日色氨酸操縱子

第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日2.原核細胞mRNA的特征（1）半衰期短（2）多順反子形式

（3）存在SD序列

原核生物中起始密碼子AUG上游7～12個核苷酸序列因其與16SrRNA3’末端反向互補而被認為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。

（4）起始密碼子常為AUG（有時GUG，甚至UUG）。第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日3.原核細胞基因的終止子根據(jù)對細菌和噬菌體DNA模板上的終止信號的分析，發(fā)現(xiàn)它們具有共同的結(jié)構(gòu)特征：①終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；②在終止點前面有一段由4～8個A組成的序列，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端為寡聚U。

UUUUUUUUUUUURNA第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點1.真核生物基因的不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）

第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日內(nèi)含子是一個基因中非編碼DNA片段，它分開相鄰的外顯子。

外顯子是一個基因中編碼蛋白序列。嚴格地說,外顯子是指保留在初級mRNA中不被剪切掉的區(qū)域,包括5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼序列和3’非翻譯區(qū)(3’UTR)。

外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)是指外顯子和內(nèi)含子的交界，又稱邊界序列。GT-AG法則

序列分析表明，幾乎每個內(nèi)含子5’端起始的兩個堿基都是GT，3’端最后兩個堿基總是AG，由于這兩個堿基的高度保守性和存在的廣泛性，有人把它稱為GT-AG法則，即：5’GT…AG3’。

第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日衛(wèi)星DNA真核生物基因組中高度重復的DNA,有一些20～30bp的極短序列，且以數(shù)千個拷貝的串連方式排列，這種序列稱為衛(wèi)星DNA。2.衛(wèi)星DNA在染色體DNA片段的氯化銫密度梯度離心中，由于浮力密度的不同，這種重復序列在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶，因此稱之為衛(wèi)星DNA。第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日3.真核生物mRNA的特征（1）5’端的帽子結(jié)構(gòu)

幾乎全部的真核mRNA端都具“帽子”結(jié)構(gòu)。雖然真核生物的mRNA的轉(zhuǎn)錄以嘌呤核苷酸三磷酸（pppAG或pppG）領頭，但在5’端的一個核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7GpppAGpNp）。mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。不同真核生物的mRNA具有不同的帽子。

第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日(1)有助于mRNA越過核膜，進入胞質(zhì)；(2)保護5′不被核酶降解；(3)翻譯時供IFⅢ（起始因子）和核糖體識別，是翻譯所必需的。第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（2）3’末端Poly（A）尾巴除了組蛋白以外，真核生物mRNA3’末端都有由40~200個A組成的Poly（A）尾巴。Poly(A)尾不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后的前體mRNA以ATP為前體，由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，即Ploy(A)聚合酶催化聚合到3’末端。

第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日Poly（A）尾巴在基因工程操作中的作用：A、用Poly（T）作為合成cDNA第一鏈的引物。B、用Poly（T）純化柱從總RNA中分離mRNA寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。是mRNA由細胞核進入細胞質(zhì)所必需的形式；它大大提高了mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛從細胞核進入細胞質(zhì)時，其多聚(A)尾巴一般比較長，隨著mRNA在細胞質(zhì)內(nèi)逗留時間延長，多聚(A)逐漸變短消失，mRNA進入降解過程。它可促進核糖體的有效循環(huán)。Poly（A）尾巴有三個方面的功能：第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日寡聚（dT）-纖維素柱層析法常規(guī)方法RNA(高鹽緩沖液)寡聚（dT）纖維素柱低鹽溶液和蒸餾水洗脫較高純度的mRNA加樣結(jié)合第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日DynabeadsOligo(dT)25是一種直徑為2.8μm的均一的、超順磁的微球體，其表面的5’連接鍵共價結(jié)合了由25個脫氧核糖核苷組成的長鏈。

mRNA磁珠分離法

第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日二從DNA到蛋白質(zhì)（一）中心法則1970年特明(H.M.

Temin)以在勞斯肉瘤病毒內(nèi)發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進一步發(fā)展和完善了“中心法則”。第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（二）基因表達從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達。

DNARNA轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白質(zhì)第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日原核生物和真核生物比較1.啟動子第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日2.RNA聚合酶原核生物真核生物RNA聚合酶僅一種RNA聚合酶有三種RNA聚合酶Ⅰ大部分rRNARNA聚合酶ⅡmRNA和snRNARNA聚合酶ⅢtRNA和5sRNA全酶的組成是α2ββ'σ

第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日3.表達過程原核生物真核生物無細胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同時進行，基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。有細胞核，轉(zhuǎn)錄在細胞核中，翻譯在細胞質(zhì)中，并且轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有加工過程，基因表達的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同水平。第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日4.表達的調(diào)控（1）真核生物的表達調(diào)控信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄因子信號分子受體分子離子通道第二信使分子蛋白激酶或磷酸酯酶活性轉(zhuǎn)錄因子基因表達第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日（2）原核生物的表達調(diào)控①代謝物對基因活性的調(diào)節(jié)

第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日可誘導調(diào)節(jié)是指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關(guān)閉的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質(zhì)的誘導下使基因活化?？勺瓒粽{(diào)節(jié)中的基因平時都是開啟的，處在產(chǎn)生蛋白質(zhì)和酶的工作過程中，但由于一些特殊代謝物或化合物的積累將其關(guān)閉，阻遏了基因的表達，所以稱為可阻遏基因。第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日②弱化因子對基因活性的影響

第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日③降解物對基因活性的調(diào)節(jié)

添加葡萄糖能量得到滿足細菌的腺苷酸環(huán)化酶抑制環(huán)腺苷酸(cMAP)↓cAMP＋受體蛋白↓調(diào)控的基因就不表達第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日④細菌的應急反應

氨基酸饑餓

空載tRNA

鳥苷四磷酸（ppGpp）鳥苷五磷酸（pppGpp）

關(guān)閉一些基因的表達開啟氨基酸合成基因的表達生產(chǎn)各種RNA、糖、脂肪和蛋白質(zhì)在內(nèi)的幾乎全部生物化學反應過程均被停止

第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日⑤環(huán)腺苷酸受體蛋白對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

葡萄糖缺乏cAMP合成↑cAMP受體蛋白促進RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動子抑制RNA聚合酶結(jié)合一些基因的啟動子第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日總結(jié)基因工程操作中應注意的真核生物與原核生物的差異1.基因結(jié)構(gòu)的差異2.啟動子和RNA聚合酶的差異3.蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工（前體切割、二硫鍵、糖基化、甲基化、羰基化、磷酸化、乙?；⒘蛩峄?、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化）4.基因表達的調(diào)節(jié)（表達量）5.載體的差異6.蛋白質(zhì)的純化方便第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日1．遺傳密碼與信息流

儲存在DNA上的遺傳信息通過mRNA傳遞給蛋白質(zhì)，mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過遺傳密碼的破譯來實現(xiàn)的。mRNA上每3個核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個氨基酸，這3個核苷酸就稱為密碼子，也叫三聯(lián)子密碼。蛋白質(zhì)是通過遺傳信息流由基因控制的。三基因研究進展第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日2．結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因

結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)是可以轉(zhuǎn)錄成為各種RNA(如rRNA、tRNA、snRNA)直接行使功能，或者轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)然后翻譯成多肽鏈，最終形成各種功能蛋白質(zhì)和酶。

從廣義上講，任何一種能夠調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因都可叫做調(diào)節(jié)基因(regulatorygene)，一般情況下則是指基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)別的基因活性的基因(如阻遏基因等)。首先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后由mRNA翻譯成阻遏蛋白質(zhì)或激活蛋白質(zhì)，通常也稱為轉(zhuǎn)錄因子或反式作用因子。它們通常結(jié)合到結(jié)構(gòu)基因的非編碼區(qū)的順式元件上起調(diào)控作用。第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日3．管家基因和奢侈基因

具有相同遺傳信息的個體細胞間其所利用的基因并不相同，有的基因活動是維持細胞基本代謝所必需的，而有的基因則在一些分化細胞或受到外界刺激的細胞中活動。前者稱為管家基因(house-keepinggene)，如編碼核糖體蛋白、線粒體蛋白、糖酵解酶等的基因；而后者被稱為奢侈基因(1uxurygene)，第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日4．移動基因

1967年在大腸埃細菌的乳糖操作子的研究中第一次發(fā)現(xiàn)了稱為插入序列(insertionsequence，IS)的轉(zhuǎn)座因子。直至1980年夏皮羅(Shapiro)等人證實了可移位的遺傳基因存在，說明某些基因具有移動性。轉(zhuǎn)座子也稱易位子，是由兩個重復順序夾著一個或多個結(jié)構(gòu)基因組成。有的轉(zhuǎn)座子的重復序列就是IS。轉(zhuǎn)座子也和IS一樣，能從一個位點轉(zhuǎn)座到另一個位點，或從一個復制子轉(zhuǎn)座到另一個復制子。轉(zhuǎn)座子屬于可移動的遺傳因子—移動基因。除了轉(zhuǎn)座因子外，病毒和質(zhì)粒都是染色體外的可以移動的遺傳物質(zhì)，都必須依賴宿主而復制。第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日5．重疊基因

核苷酸序列是彼此重疊的兩個基因稱為重疊基因(overlappinggenes)或鑲嵌基因(nestedgenes)。第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日6．假基因

假基因是多基因家族中的成員，因其堿基順序發(fā)生某些突變而失去功能，不能表達或表達異常，生成無生物活性的多肽。假基因DNA順序可在相應基因名稱之前加φ表示，如α珠蛋白基因家族中φξ1與功能性ξ2基因同源，φξ1有3個堿基被取代，其中密碼子6的GAG—TAG(谷氨酸→終止密碼)發(fā)生無義突變。第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日例如，在珠蛋白、免疫球蛋白、組織相容性抗原(histocompatibi1ityantigen)以及肌動蛋白和微管蛋白等基因家族(genefamily)中，都存在著這樣的功能失活的假基因。

第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日(1)重復的假基因

許多假基因都是同“親本基因”(Parental8ene)連鎖的，而且同其編碼區(qū)及側(cè)翼序列的DNA具有很高的同源佳?？梢姰a(chǎn)生此種類型的假基因拷貝的一種可能的機理是，由含有“親本基因”的染色體區(qū)段串聯(lián)重復形成，故稱之為重復的假基因。珠蛋白基因家族中的假基因即屬于這一種類型。第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日

(2)加工的假基因

除了重復的假基因外．在真核生物的染色體基因組中還存在著一類加工的假基因(processedpseudogene)。這類假基因沒有與“親本基因”連鎖，而且其結(jié)構(gòu)是同轉(zhuǎn)錄本而非“親本基因”類似。例如，它們都沒有啟動子和間隔子，但在基因的3’—末端則都有一段延伸的腺嘌呤短序列，恰似mRNA分子3’—末端的poly(A)尾巴。這些特征表明，此類假基因很可能是來自加工的RNA之DNA拷貝，因此稱之為加工的假基因。

第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日第四十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日7．串聯(lián)基因簇

中度重復DNA有許多類型的重復序列組成。多重復序列組成的基因簇在重復區(qū)域的下游出現(xiàn)，這些通常是其產(chǎn)物需求量很高的基因，rDNA(編碼rRNA)就是其中一例。編碼18S、5.8S和28SrRNA的45S前體的基因就有約10～10000個拷貝的重復序列，其拷貝數(shù)因物種而異。人類基因組中45S基因在5個不同的染色體上都有排列，每一排列包含約40個拷貝。在分裂間期這些區(qū)域都處于核仁區(qū)，核仁是細胞核中的致密區(qū)域，是rRNA合成和修飾的工廠。另一個串聯(lián)基因簇的例子是組蛋白基因，其產(chǎn)物在S期大量產(chǎn)生，5種組蛋白基因在一個基因簇，有的可直接重復達數(shù)百次。第四十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期日8．基因組

基因組(genome)是1924年提出的，是指一個生物體、細胞器或病毒的全部基因。原核生物基因組僅由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，含有一個復制起點，它的基因組就是它的整個染色體。但對于二倍體的高等生物，能維持配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體構(gòu)成的一個基因組。對于植物細胞而言，則有3個基因組，即染色體基因組(核基因組)、線粒體基因組和葉綠體