液體菌種制備技術(shù)規(guī)程：香菇

液體菌種制備技術(shù)規(guī)程：香菇范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了香菇液體菌種的術(shù)語和定義、基本要求、生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)檔案管理等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于香菇液體菌種的制備。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150壓力容器GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728食用菌術(shù)語GB19170香菇菌種GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。食用菌液體菌種發(fā)酵罐ediblemushroomliquidstrainfermenter進(jìn)行食用菌液體菌種培養(yǎng)的專用發(fā)酵設(shè)備，應(yīng)符合GB150要求。食用菌液體菌種接種器ediblemushroomliquidstraininoculator將液體菌種按無菌操作要求接種到固體培養(yǎng)基物料上的工具?？諝鈮嚎s機aircompressor能為食用菌液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)提供壓縮空氣的設(shè)備?？諝膺^濾器airfilter能對食用菌液體菌種發(fā)酵罐所用空氣進(jìn)行濾除雜菌和其他雜質(zhì)，達(dá)到無菌潔凈要求的設(shè)備。罐壓jarpressure在液體菌種發(fā)酵制備過程中發(fā)酵罐內(nèi)保持的空氣壓力（表壓），單位：MPa。通氣量ventilationvolume液體菌種培養(yǎng)過程中發(fā)酵罐體積與每分鐘通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積的比例。用V/V（發(fā)酵罐體積/通入空氣體積）表示。接種量inoculationamount菌種體積與培養(yǎng)基體積的比例，用百分?jǐn)?shù)表示。液體菌種菌齡periodofliquidstrainrunning菌種接入培養(yǎng)基開始計算的液體菌種培養(yǎng)時間。發(fā)酵罐空消emptyfermentersterilization對尚未加水投料的空發(fā)酵罐進(jìn)行高壓滅菌。投料feeding將配置好的培養(yǎng)基投放到培養(yǎng)器中。定容constantvolume培養(yǎng)器中加入培養(yǎng)基后，加水至所要求體積發(fā)酵罐實消fermentersterilization指對投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。罐壓回零jarpressurereturningtozero液體菌種培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐內(nèi)壓力回到零點。搖瓶液體菌種liquidspawninflask裝至玻璃菌種瓶內(nèi)在磁力攪拌器或恒溫?fù)u床上培養(yǎng)的液體菌種。培養(yǎng)基起始pHinitialpHvalueofmedium液體培養(yǎng)基滅菌后尚未接種時的pH。基本要求人員要求工作人員應(yīng)該保持個人衛(wèi)生，進(jìn)液體菌種發(fā)酵車間必須穿戴經(jīng)滅菌處理的工作服、口罩、鞋、帽。產(chǎn)地環(huán)境要求場所要求生產(chǎn)場所符合NY/T528的環(huán)境衛(wèi)生要求，場地開闊、路面硬化、衛(wèi)生清潔。廠房要求廠房設(shè)計應(yīng)符合NY/T528要求，增設(shè)搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室。應(yīng)設(shè)置與職工人數(shù)相適應(yīng)的更衣室，車間入口處應(yīng)設(shè)置洗手、消毒和干手設(shè)施。過道應(yīng)設(shè)置風(fēng)淋室。車間地面應(yīng)能防水、防腐蝕、防滲漏、防滑，易清洗，有適當(dāng)?shù)呐潘露龋?.0°～1.5°）和良好的排水系統(tǒng)。墻壁和天花板應(yīng)能防潮、防霉、防水。門窗應(yīng)設(shè)置防蚊蠅紗網(wǎng)。車間安裝排氣管道或者排風(fēng)設(shè)備。液體菌種接種間應(yīng)設(shè)置緩沖間。搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室應(yīng)符合GB50073要求。車間設(shè)封閉式廢物桶。生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施生產(chǎn)設(shè)備與用具應(yīng)具有磅秤、天平、高壓蒸汽滅菌鍋、發(fā)酵罐、液體菌種接種器、超凈工作臺、調(diào)溫設(shè)備、除濕設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床或磁力攪拌器、冰箱、顯微鏡等及常規(guī)用具。壓力容器應(yīng)經(jīng)政府有關(guān)部門檢驗合格，符合GB150要求。應(yīng)具有備用電源。基本設(shè)施培養(yǎng)基配制室、搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室規(guī)模要配套，布局合理，其中培養(yǎng)基配制室空間潔凈度應(yīng)達(dá)到萬級以上，搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室要有調(diào)溫設(shè)施，空間潔凈度應(yīng)達(dá)到百級。菌種檢驗室和母種制作室要有相應(yīng)的實驗檢測設(shè)備和制種用的滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。生產(chǎn)技術(shù)工藝流程工藝流程見圖1。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)無菌空氣搖甁液體菌種母種活化基質(zhì)培養(yǎng)基配制投料滅菌發(fā)酵罐液體菌種發(fā)酵罐空消接種香菇液體菌種生產(chǎn)工藝流程品種選擇選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性好的香菇品種，從具有相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種且種性清楚。引種后必須進(jìn)行適應(yīng)性出菇試驗驗證。母種活化母種活化配方及操作流程應(yīng)符合NY/T528要求。活化后母種質(zhì)量應(yīng)符合GB19170要求。搖瓶液體菌種生產(chǎn)容器使用無色或近無色專用玻璃菌種甁，可用棉塞（梳棉或化纖棉）、硅膠塞、專用封口透氣膜封口。培養(yǎng)基配方可選用以下配方：配方1：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B15mg，水1L，pH6.0～6.5；配方2：玉米粉20g，葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏4g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，維生素B15mg，水1L，pH6.0～6.5。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求，培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求，玉米粉應(yīng)過20目篩。培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，玉米粉先用水?dāng)嚢杈鶆颍b入搖瓶中，混合均勻，裝液量為搖甁容量的2/5～3/5，瓶塞封口，并用硫酸紙或牛皮紙包扎。滅菌將分裝好的搖瓶放入滅菌鍋內(nèi)，鍋內(nèi)留有一定的空隙。檢查鍋內(nèi)水位，立即滅菌。滅菌蒸汽壓力升至0.1MPa～0.12MPa，恒壓維持35min～40min。接種待培養(yǎng)基冷卻后于消毒過的超凈工作臺上，用經(jīng)火焰消毒并冷卻后的接種針挑取5～6塊（3～5）mm×（3～5）mm的母種塊迅速轉(zhuǎn)接于待接種搖甁培養(yǎng)基內(nèi)。搖瓶菌種培養(yǎng)種結(jié)束后封口，放入恒溫箱中23℃～25℃靜置培養(yǎng)1d，然后置于搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床溫度控制在23℃～25℃，轉(zhuǎn)速140r/min～160r/min，培養(yǎng)時間10d～12d。搖瓶菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液澄清透明，無雜菌、無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常；菌絲球、菌絲片段密集，不低于整個培養(yǎng)液80%，均勻懸浮于液體培養(yǎng)基中不分層。發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)煮罐、空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時，應(yīng)煮罐和空消。蒸氣壓力0.15MPa、溫度126℃，維持40min。液體菌種培養(yǎng)基配方可選用以下配方：配方1：玉米粉20g，葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏4g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，維生素B15mg，消泡劑0.3g，水1L，pH6.0～6.5；配方2：馬鈴薯100g（煮汁），葡萄糖10g，麥麩40g（煮汁），蛋白胨2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，消泡劑0.3g，水1L，pH6.0～6.5；配方3：玉米粉20g，麥麩20g（煮汁），葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，消泡劑0.3g，水1L，pH6.0～6.5。生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求，培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求，玉米粉應(yīng)過20目篩。投料和定容用水把淀粉、玉米粉等原料攪拌均勻，不能有結(jié)塊，通過吸管或漏斗加入罐體，裝液量為罐體容量的70%～80%，加入0.03%消泡劑，通入空氣攪拌1min～2min，混合均勻，擰緊上料口蓋。滅菌發(fā)酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20cm，關(guān)閉進(jìn)、排水閥門加熱。待加熱層蒸汽壓力達(dá)到0.05MPa時，緩慢打開排氣閥降壓至0MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11MPa；待發(fā)酵罐培養(yǎng)層蒸汽壓力達(dá)到0.05MPa時，緩慢打開排氣閥降壓至0MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11MPa，同時打開空氣過濾器滅菌，微開排氣閥，維持50min～60min。冷卻滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥降壓至0MPa，加熱層通入冷水降溫；同時緩慢打開發(fā)酵罐培養(yǎng)層排氣閥降壓，待壓力接近0MPa時向培養(yǎng)層內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04MPa～0.05MPa，培養(yǎng)液溫度降至25℃以下時，關(guān)閉加熱層進(jìn)水閥。接種接入搖甁菌種，接種量為2%～4%。將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，輕微打開呼吸器閥門，使發(fā)酵罐壓力為0MPa。點燃火焰圈，在火焰保護(hù)下用鑷子去掉接種管上的牛皮紙和瓶塞，打開接種口閥門，將接種管插入接種口，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。拔出接種管，關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，打開空氣壓縮機。發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長情況，適時調(diào)節(jié)進(jìn)氣按鈕，通入適量無菌空氣，同時調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.01MPa～0.03MPa，培養(yǎng)溫度控制在23℃～25℃，培養(yǎng)9d～10d。液體菌種檢測形態(tài)學(xué)觀察。主要是通過肉眼觀察菌球形態(tài)，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。霉菌檢驗。按照無菌操作從取樣閥取少量疑有霉菌污染的培養(yǎng)液，接種于GB/T4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，置于28℃～30℃恒溫培養(yǎng)48h，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無雜菌污染；若出現(xiàn)白色以外的雜色者，或有異味者為霉菌污染物，必要時進(jìn)行水封片鏡檢。細(xì)菌檢驗。按照無菌操作從取樣閥取少量疑有細(xì)菌污染的培養(yǎng)液，接種于GB/T4789.28中規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，置于28℃～30℃恒溫培養(yǎng)24h～48h，觀察培養(yǎng)液是否渾濁。培養(yǎng)液渾濁，為有細(xì)菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無細(xì)菌污染。pH測定。取樣用pH計或pH試紙測定菌液酸堿度。pH小于5為不正常。菌絲濕重測定。稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)1000r/min離心5min，稱重。發(fā)酵罐液體菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)感官要求感官指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。香菇發(fā)酵罐液體菌種感官要求項目要求菌液色澤菌絲球或菌絲片段呈白色，菌液呈淺棕色菌液形態(tài)培養(yǎng)液澄清透明，菌絲球、菌絲片段均勻懸浮于液體中，不分層，直徑小于3.5mm菌液氣味有香菇液體培養(yǎng)時特有的香氣，無酸、臭等異味，發(fā)酵罐排氣口氣味正常，無明顯改變顯微鏡下菌絲形態(tài)可見香菇菌種液體培養(yǎng)中特有的菌絲形態(tài)，菌絲粗壯，分支較少，無雜菌理化指標(biāo)理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。香菇發(fā)酵罐液體菌種理化指標(biāo)理化指標(biāo)要求pH5.3～6.0菌絲濕重（g/mL）0.15～0.18貯藏香菇液體菌種生產(chǎn)后應(yīng)立即使用，如不能立即使用，需進(jìn)行貯藏。貯藏環(huán)境溫度低于20℃。發(fā)酵罐內(nèi)液體菌種，持續(xù)通無菌空氣，保持罐壓0.01MPa～0.03MPa，可存放2d。生產(chǎn)檔案母種、搖瓶液體菌種和發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)都要有詳實的