Velcade誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞凋亡研究

Velcade誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞凋亡研究【摘要】為了研究velcade誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞凋亡效應及機制，采用臺盼藍拒染法檢測2、10、50和100nmol/Lvelcade處理U266細胞活率，用流式細胞術分析Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基，用半定量RT-PCR法檢測bcl-2mRNA的表達。結果表明：velcade抑制U266細胞增殖；誘導U266細胞凋亡，24小時Annexin-V陽性細胞比例增高，△ψM降低；12小時時活性氧明顯增高，熒光強度增強；抗凋亡基因bcl-2表達降低。結論：velcade對U266細胞具有增殖抑制和殺傷作用，其可通過內(nèi)源性細胞凋亡信號通路誘導U266細胞凋亡。

【關鍵詞】velcade;多發(fā)性骨髓瘤;細胞凋亡

MultipleMyelomaCellLineU266ApoptosisInducedbyVelcade

AbstractToinvestigatetheeffectofvelcadeonmultiplemyelomacelllineU266apoptosisanditsmechanism，cellviabilitywasestimatedbytrypanbluedyeexclusion.Annexin-V，mitochondrialtransmembranepotential(Δψm)andreactiveoxygenspecies(ROS)labeledbyDCFHDAwereexaminedbyflowcytometry，theexpressionofbcl-2mRNAwasdetectedbysemi-quatitativeRT-PCR.TheresultsshowedthatthevelcadeinhibitedthegrowthofU266cellsandreducedcellviabilityaccompaniedbyappearanceofmorphologiccharacteristicsofapoptosis.Velcadeat50nmol/LincreasedAnnexinVpositivityandfluorescenceintensityofDCFbecauseofROSgenerationwhileitdecreasedtheΔψmofU266cells.Expressionofanti-apoptoticgenebcl-2mRNAalsodecreased.ItisconcludedthatvelcadeinhibitethegrowthandreducecellviabilityofU266cells.VelcadecaninduceU266cellsapoptosisbyintrinsiccellapoptoticpathway.

Keywordsvelcade;multiplemyeloma;apoptosis

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細胞克隆性增生的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，多發(fā)生于老年人。隨著社會人口的老齡化，其發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢。幾十年來對MM一直采用激素和細胞毒性藥物聯(lián)合治療，盡管近年來加用反應停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療，但其仍是一種不可治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。由此可見，開發(fā)新的治療方法有重要的臨床價值。蛋白酶體抑制劑近年來作為MM新的治療制劑用于臨床試驗，本研究就臨床新藥蛋白酶體抑制劑velcade誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞的凋亡作用進行探討。

材料和方法

細胞培養(yǎng)

U266細胞置于含10%的熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2和95%空氣濕度條件下進行培養(yǎng)。實驗過程中，細胞以×105細胞/毫升的密度接種培養(yǎng)，并與不同濃度velcade一起進行孵育，對照加DMSO。細胞活率由臺盼藍拒染法檢測，根據(jù)處理組存活細胞數(shù)與死細胞數(shù)的比例來計算。形態(tài)學觀察，細胞用cytospin(Shandon，Runcorn，UK)收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學顯微鏡下觀察。每次試驗重復3次。生長抑制率及細胞活率按如下公式計算

生長抑制率＝［(對照組細胞數(shù)-處理組細胞數(shù))／對照組細胞數(shù)］×100%存活率＝［活細胞數(shù)／(活細胞數(shù)＋死細胞數(shù))］×100%

Annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基的流式細胞儀分析

Annexin-V分析

使用FITC標記的AnnexinV和PI雙染法檢測細胞凋亡，根據(jù)BectonDickinsonBiosciences公司提供的說明書進行操作。簡單地說，取×105細胞，經(jīng)PBS漂洗后加100μl結合緩沖液，重懸細胞，加5μlAnnexinV-FITC，10μlPI避光孵育15分鐘后加400μl結合緩沖液，用流式細胞儀檢測。

線粒體跨膜電位(Δψm)檢測

取5×105細胞，用PBS清洗1次，加入10μg/mlRh12337℃孵育30分鐘，用PBS漂洗1次，加入終濃度10μg/mlPI4℃暗處放置30分鐘，用流式細胞儀檢測。

活性氧測定細胞內(nèi)活性氧測定方法參照文獻［1］方法進行，DCFHDA(Sigma公司產(chǎn)品)自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平呈正比。DCF的激發(fā)波長為485nm，吸收波長為530nm。將藥物處理的細胞經(jīng)過PBS洗滌，重懸于1ml含有10μmol/LDCFHDA的PBS中，以未加染料的樣品作為對照，37℃孵育20分鐘，以PBS洗滌2次，用流式細胞儀檢測5000個活細胞的熒光強度。

velcade誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266bcl-2mRNA表達的半定量RT-PCR檢測

細胞總RNA抽提收集3×106細胞，用TRIzoL試劑按說明書抽提細胞總RNA。

cDNA合成及PCR擴增方法參見文獻［2］，PCR引物：GAPDH：有義鏈5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反義鏈5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。bcl-2:有義鏈5′-ACTTGTGGCCCAGATAGG-3′，反義鏈為5′-CGACTTCGCCGAGATGTC-3′。PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析照相，在雙波長色譜掃描儀上掃描電泳帶。GAPDH片段長度216bp，bcl-2片段389bp。

結果

velcade對U266細胞增殖抑制和殺傷作用

研究結果表明，velcade可以抑制U266細胞的生長，同時伴有細胞活率的降低。U266細胞經(jīng)2、10、50和100nmol/L濃度velcade24小時處理后生長抑制率的3次均值分別為％、％、％和％，48小時時分別為％、%、％和％；在0、2、10、50和100nmol/L濃度時24小時活率分別為％、％、％、％和％，48小時時分別為％、％、％、％和%。根據(jù)活率48小時時下降70％-80％選擇藥物濃度，因此選擇velcade50nmol/L作為藥物處理濃度。

velcade對U266細胞凋亡作用

50nmol/Lvelcade處理的U266細胞呈現(xiàn)出細胞形態(tài)學改變，表現(xiàn)為染色體凝聚、細胞核破裂而細胞膜保持完整及出現(xiàn)多個凋亡小體等。24小時AnnexinV-FITC/PI雙標結果顯示，凋亡細胞比例重復3次的均值為％，明顯高于未用velcade處理對照組的%。線粒體跨膜電位檢測顯示△ψM降低，Rh123陽性細胞比率重復3次的均值為%，對照為%。

活性氧檢測

我們采用DCFHDA檢測velcade處理的U266細胞活性氧及平均熒光強度。結果發(fā)現(xiàn)，在12小時時活性氧明顯增高，平均熒光強度顯著增高，由對照的增強到，流式細胞儀直方圖右移。

bcl-2檢測

采用RT-PCR檢測內(nèi)源性細胞凋亡通路最主要的基因bcl-2。結果顯示，U266細胞經(jīng)50nmol/Lvelcade處理后，隨著作用時間的延長，其表達逐漸降低。

討論

泛素-蛋白酶體通路是由泛素化系統(tǒng)和蛋白酶體組成，在調(diào)節(jié)細胞周期和腫瘤生長中有著重要的作用，該通路參與細胞內(nèi)絕大多數(shù)的蛋白降解，如許多重要的涉及細胞信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞周期的調(diào)節(jié)蛋白。蛋白酶體存在于所有的真核細胞中，蛋白酶體抑制劑可以通過干涉這些重要蛋白的降解，觸發(fā)腫瘤細胞周期阻滯，誘導腫瘤細胞凋亡而使腫瘤進展延緩或靜止［3-7］。

Velcade是一種硼酸二肽化合物，是高選擇性、可逆性的26S蛋白酶體抑制劑，首先在美國國家腫瘤協(xié)會的一組60種腫瘤細胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤作用。velcade對MM細胞的作用表現(xiàn)在誘導細胞凋亡、抑制生長、抑制細胞黏附和骨髓血管生成等多個方面。本研究顯示，其對U266細胞具有增殖抑制作用，并隨著時間的延長和劑量的增加呈現(xiàn)增殖抑制加強，活率降低趨勢。

誘導細胞凋亡有3種信號通路：FAS信號通路、線粒體信號通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路，目前認為線粒體途徑在凋亡過程發(fā)揮樞紐作用。細胞凋亡過程中，細胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發(fā)生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細胞識別、吞噬，從而使凋亡細胞得以被清除。

AnnexinV為一種磷脂結合蛋白，可特異性地識別細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經(jīng)常被用于檢測細胞凋亡［8］。Rh123是一種親脂性陽離子，可發(fā)射綠色熒光，它可被線粒體吸收，并且其吸收量與線粒體△ψm成正比［9］。正常的活細胞因為線粒體△ψm高，所以其攝入的Rh123也高，因此細胞會發(fā)出綠色熒光。而細胞發(fā)生凋亡時線粒體△ψm會降低，細胞表現(xiàn)為Rh123低染。本研究結果顯示，Velcade處理U266細胞24小時時凋亡細胞明顯增高，△ψm明顯降低，這說明細胞大部分是通過誘導細胞凋亡而死亡的，Velcade還可通過線粒體信號通路，即內(nèi)源性凋亡途徑誘導U266細胞凋亡。

ROS是細胞有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)，主要包括O-2、OH-及其活性衍生物如H2O2、HOCl、O2等。這些物質(zhì)具有較高的反應活性，易與細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)反應，導致細胞結構的廣泛損傷，如膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)及核酸等的氧化損傷等。近年的研究認為，活性氧是細胞凋亡的信號之一，ROS的產(chǎn)生可直接或間接改變線粒體膜電位，促進CytC從線粒體內(nèi)釋放，啟動線粒體信號通路，誘導細胞凋亡［10］。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中同樣會有ROS的生成。Fribley等報道［11］蛋白酶體抑制劑velcade通過同時誘導ER應激和ROS生成引起人頭頸癌細胞凋亡，ROS的抑制劑Tiron能夠顯著抑制凋亡，caspase-9和caspase-3的活化，并且能夠阻礙ER應激相關蛋白ATF-4和CHOP/GADD153的表達。這些結果提示，ROS在ER應激誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。用DCFHDA作為熒光探針測定細胞內(nèi)ROS水平時，發(fā)現(xiàn)velcade在24小時時能明顯增高U266細胞內(nèi)活性氧水平，這說明velcade可改變多發(fā)性骨髓瘤細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導致線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生ROS增多，從而誘導U266細胞凋亡。由此我們推測，不僅線粒體途徑參與了velcade誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266細胞凋亡，而且ER應激途徑也可能通過ROS的產(chǎn)生而發(fā)揮誘導凋亡作用。

bcl-2基因是抗細胞凋亡的關鍵基因，其表達的增高與多種腫瘤有著密切關系，并且可導致腫瘤細胞抵抗糖皮質(zhì)激素、柔紅霉素、阿糖胞苷及VP16等化療藥物誘導的凋亡，使腫瘤細胞對各種化療藥物耐受，導致緩解率低［12］。bcl-2表達降低在內(nèi)源性細胞凋亡即線粒體信號通路中起關鍵作用，很多化療藥物可通過抑制bcl-2基因表達從而誘導腫瘤細胞凋亡。本研究通過半定量RT-PCR的方法檢測了bcl-2mRNA的表達，結果顯示其表達水平降低，并隨著velcade藥物作用時間的延長而表達量逐漸減少，這一結果從分子水平進一步證實了velcade的誘導細胞凋亡作用及其作用機制主要是通過線粒體信號通路。

【參考文獻】

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