分瓶細(xì)胞株細(xì)胞細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體制備細(xì)胞核移植動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和核移植技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（一）、概念

是指從動(dòng)物機(jī)體內(nèi)取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。（二）、原理細(xì)胞分裂增殖（三）過(guò)程幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液接觸抑制部分細(xì)胞“癌變”，無(wú)限傳代10代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁剝離、分瓶細(xì)胞株細(xì)胞細(xì)胞系2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：50代細(xì)胞（大多死少不死）（大多死少不死）強(qiáng)調(diào)一：細(xì)胞貼壁過(guò)程■細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁?！雠囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無(wú)毒、易于帖附?！霎?dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。強(qiáng)調(diào)二：接觸抑制有關(guān)概念:原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。有關(guān)概念

細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到40~50代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。

細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無(wú)限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。

細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別：細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液接觸抑制部分細(xì)胞“癌變”，無(wú)限傳代10代細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁剝離、分瓶細(xì)胞株細(xì)胞細(xì)胞系2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：50代細(xì)胞（大多死少不死）（大多死少不死）思考題：1、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？2、為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？因?yàn)檫@些組織或器官，分裂能力旺盛，易于培養(yǎng)。成塊組織使細(xì)胞靠在一起限制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且細(xì)胞不能與培養(yǎng)液充分接觸，不利于培養(yǎng)。3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)是什么成份？催化蛋白質(zhì)水解。細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)(膠原蛋白等)。4、細(xì)胞膜的主要成份是什么？蛋白質(zhì)和磷脂5、胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉嗎？能6、既然胰蛋白酶能將細(xì)胞消化掉，那將動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞要注意什么問(wèn)題呢？7、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？注意時(shí)間的控制

不能，因?yàn)閮烧叩淖钸mPH不同，而正常組織細(xì)胞的生存環(huán)境與胰蛋白酶的最適PH較接近3.總結(jié)：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸浮液剪碎用胰蛋白酶處理10代細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無(wú)限傳代單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。傳代10-50代左右，增長(zhǎng)緩慢以至于完全停止，部分細(xì)胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）為什么用胰蛋白酶處理？原代培養(yǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞貼壁、接觸抑制繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。原代培養(yǎng)歸納過(guò)程取

的組織、器官細(xì)胞懸浮液

酶

細(xì)胞貼壁、接觸抑制

培養(yǎng)10代細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞株無(wú)限傳代細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞加

液遺傳物質(zhì)

改變遺傳物質(zhì)

改變動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物胰蛋白培養(yǎng)原代傳代未已50代細(xì)胞討論對(duì)于多細(xì)胞生物來(lái)說(shuō)，細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的知識(shí)，認(rèn)為體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)該需要什么樣的條件？4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件:1）無(wú)菌無(wú)毒的環(huán)境：

適宜的溫度：人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4液體合成培養(yǎng)基：（糖、氨基酸）、促生長(zhǎng)因子、（無(wú)機(jī)鹽、微量元素）等；通常還需加入血漿、血清等天然成分。4）氣體環(huán)境：2）營(yíng)養(yǎng)：3）溫度和pH：“95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細(xì)胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的PH。對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無(wú)菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過(guò)程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物，防止對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞造成危害。5.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體、基因工程技術(shù)、檢測(cè)有毒物質(zhì)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用等。植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的

細(xì)胞培養(yǎng)基特有成分

、植物激素葡萄糖、培養(yǎng)結(jié)果植物體培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無(wú)病毒植株獲得全能性增殖蔗糖動(dòng)物血清細(xì)胞株、細(xì)胞系細(xì)胞2、在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞是（）

A．獲得不死性的細(xì)胞B．10代以內(nèi)細(xì)胞

C．原代細(xì)胞D．傳代細(xì)胞1、動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是（）

A.動(dòng)物細(xì)胞融合B.單克隆抗體

C.胚胎移植D.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

AD課堂反饋練習(xí)3、在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的有關(guān)敘述中正確的是：（）A、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的目的只是為了獲得大量的細(xì)胞分泌蛋白B、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)前要用胰蛋白酶使細(xì)胞分散C、細(xì)胞的癌變發(fā)生在原代培養(yǎng)向傳代培養(yǎng)的過(guò)渡過(guò)程中D、培養(yǎng)至50代后傳代細(xì)胞遺傳物質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變B4、一般說(shuō)來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)需要滿足以下條件（）①無(wú)毒的環(huán)境②無(wú)菌的環(huán)境③培養(yǎng)基需要加入血清④溫度與動(dòng)物體溫相似⑤需要O2，不需要CO2⑥CO2能調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PHA、①②③④⑤⑥B、①②③④C、①③④⑤⑥

D、①②③④⑥D(zhuǎn)5、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)（）①細(xì)胞貼壁②有絲分裂③細(xì)胞分化④接觸抑制⑤減數(shù)分裂⑥原代培養(yǎng)一般傳1－10代A、①②④⑥

B、②③④⑤C、①③④⑥

D、③④⑤⑥A6、下圖是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程示意圖。請(qǐng)據(jù)此回答：（1）容器A中放置的是動(dòng)物器官或組織。它一般取自______________________。（2）容器A中的動(dòng)物器官或組織首先要進(jìn)行的處理是

，然后用

酶處理，這是為了使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)，這樣做的目的是

。動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物剪碎胰蛋白使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，便于培養(yǎng)（3）培養(yǎng)首先在B瓶中進(jìn)行，瓶中的培養(yǎng)基成分有

________________等。在此瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間后，有許多細(xì)胞衰老死亡，這是培養(yǎng)到第

代。（4）為了把B瓶中的細(xì)胞分裝到C瓶中，用

處理，然后配置成

，再分裝。`動(dòng)物血清10胰蛋白酶細(xì)胞懸浮液

概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物核移植（難度高）受體細(xì)胞減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物胚胎細(xì)胞核移植：體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易卵細(xì)胞C母綿羊子宮Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植胚胎移植早期胚胎多利羊分娩卵裂融合后的卵細(xì)胞細(xì)胞拆合技術(shù)妊娠多莉羊的培育過(guò)程無(wú)性生殖克隆羊培育過(guò)程黑面綿羊去核卵細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植重組細(xì)胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利１、動(dòng)物的克隆與植物克隆一樣嗎？２、用動(dòng)物體細(xì)胞進(jìn)行克隆的過(guò)程,其實(shí)際操作過(guò)程是什么？動(dòng)物克隆過(guò)程的實(shí)際是細(xì)胞核移植不一樣思考題1.體細(xì)胞核移植的過(guò)程（以高產(chǎn)奶牛為例）體細(xì)胞培養(yǎng)甲牛乙牛MⅡ卵母細(xì)胞去除核去核卵母細(xì)胞重組細(xì)胞卵裂重組胚胎代孕母牛丙移植體細(xì)胞群克隆牛細(xì)胞核移植胚胎移植物理或化學(xué)方法激活體細(xì)胞注入細(xì)胞融合供體細(xì)胞（供核）細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞卵巢卵母細(xì)胞（MⅡ中期：供質(zhì)）去核無(wú)核卵母細(xì)胞注入細(xì)胞融合重組細(xì)胞重組胚胎胚胎移植代孕母體生出與供體奶牛遺傳基礎(chǔ)相同的犢牛歸納:1.共分成兩大階段：核移植和胚胎移植2.取卵細(xì)胞作受體細(xì)胞的原因是:它是最大的細(xì)胞,易操作3.嚴(yán)格來(lái)說(shuō)新個(gè)體有卵巢母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)所以有兩個(gè)親本的性狀核移植過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)１、在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？為使核移植動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有利用價(jià)值的動(dòng)物提供的細(xì)胞。２、用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，為什么？10代以內(nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變思考題3、體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是，克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來(lái)自受體卵母細(xì)胞思考題4、對(duì)比多莉羊和課本高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程，找出操作過(guò)程的不同點(diǎn)？多莉克隆過(guò)程的受體細(xì)胞是去核卵細(xì)胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程的受體細(xì)胞是去核卵母細(xì)胞；多莉克隆過(guò)程是將供體細(xì)胞核注入受體細(xì)胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過(guò)程是將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞。5、討論分析上述哪一種措施更科學(xué)？并說(shuō)明理由？卵母細(xì)胞當(dāng)中的細(xì)胞周期蛋白含量、活性比卵細(xì)胞高，用它作受體更容易成功，將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞，使克隆動(dòng)物更像供體動(dòng)物，操作也方便。思考題胚胎移植技術(shù)試管動(dòng)物（嬰兒）培養(yǎng)過(guò)程卵細(xì)胞精子體外受精受精卵胚胎新個(gè)體母體子宮內(nèi)孕育、產(chǎn)出2.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1、加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育2、保護(hù)瀕危物種，增加存活數(shù)量3、克隆動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白4、可以作為異種移植的供體，可以用于組織器官的移植3.體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題：（1）成功率仍然非常低。（2）絕大多數(shù)克隆動(dòng)物還存在健康問(wèn)題。許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大，異常肥胖，發(fā)育困難，臟器缺陷，免疫失調(diào)等。（3）對(duì)克隆動(dòng)物食品的安全性問(wèn)題存有爭(zhēng)議。1、在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞是--------------------（）

A．細(xì)胞系B．細(xì)胞株

C．原代細(xì)胞D．傳代細(xì)胞2、動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是----（）

A.動(dòng)物細(xì)胞融合B.單克隆抗體

C.胚胎移植D.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

AD課堂反饋：3、用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的組織和細(xì)胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動(dòng)物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細(xì)胞（）

A.容易產(chǎn)生各種變異

B．具有更強(qiáng)的全能性

C.取材十分方便

D．分裂增殖的能力強(qiáng)D4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的重要區(qū)別在于-------------------------（）

A.培養(yǎng)基不同；

B.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無(wú)菌條件下進(jìn)行；

C.動(dòng)物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能；

D.動(dòng)物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株。A5.下列關(guān)于細(xì)胞工程的敘述中，錯(cuò)誤的是--------------------------------------------（)

A．植物細(xì)胞融合必須先制備原生質(zhì)體

B．試管嬰兒技術(shù)包括人工授精和胚胎移植兩方面C．經(jīng)細(xì)胞核移植培育出的新個(gè)體只具有一個(gè)親本的遺傳物質(zhì)

D．用于培養(yǎng)的植物器官或組織屬于外植體C常用止血包扎方法

院前急救總的任務(wù)：

是維持患者的生命、防止再損傷、減輕患者痛苦，為進(jìn)一步診治創(chuàng)造條件，提高搶救成功率，減少傷殘率院前急救的原則：1、先救治后運(yùn)送2、先重傷后輕傷3、急救與呼救并重4、先排險(xiǎn)后施救5、救治、監(jiān)護(hù)與轉(zhuǎn)運(yùn)的一致性院前急救的原則：6、先復(fù)蘇后固定7、先止血后包扎8、爭(zhēng)分奪秒，就地取材9、保留并低溫保存離斷的肢體或器官?，F(xiàn)場(chǎng)傷員的分類與標(biāo)記：第一急救區(qū)紅色：傷情嚴(yán)重，危及生命者第二急救區(qū)黃色：嚴(yán)重，但無(wú)危及生命者第三急救區(qū)綠色：受輕傷者，可以自己行走第四急救區(qū)黑色：死亡傷病員常用急救止血方法指壓動(dòng)脈止血法直接壓迫止血法（加壓包扎）止血帶止血法

指壓止血法用一定的力量將動(dòng)脈壓在骨骼的淺面，壓扁血管以達(dá)到壓迫止血的目的。減少出血，不能完全止血，只能短時(shí)間控制大出血，應(yīng)盡快改用其他方法。指壓止血法常用壓迫點(diǎn)：面動(dòng)脈、枕后動(dòng)脈、尺橈動(dòng)脈、肱動(dòng)脈、股動(dòng)脈、腘動(dòng)脈等。直接壓迫止血法（加壓包扎止血法）抬高受傷部位；無(wú)菌敷料覆蓋傷口直接壓迫5分鐘；繼續(xù)出血，在敷料上再加敷料，不要除去最初的敷料。止血帶止血法一般用于控制四肢出血，但損傷大、急性腎功能不全等嚴(yán)重并發(fā)癥；止血帶壓迫靜脈血管，有時(shí)會(huì)使得出血增多，肢體腫脹，不常規(guī)使用，只作為控制；止血帶止血法扎止血帶部位：一般在出血部位的近端，盡量靠近傷口，以減少缺血范圍；上臂的中下1/3處忌扎止血帶，以免損傷橈神經(jīng)；前臂、小腿不宜上止血帶，因?yàn)橛袃筛穷^，使血液阻斷不全。止血帶止血法常用的止血帶止血法:

橡皮管止血帶止血法卡式止血帶止血法三角巾止血帶止血法止血帶止血法用毛巾或紗布加以襯墊，左手拇指、食指、中指夾住止血帶一端，右手將止血帶另一端繞傷肢兩圈，再用左手食指、中指夾住止血帶拉出，形成一個(gè)v字形的方法。當(dāng)出血停止，遠(yuǎn)端摸不到動(dòng)脈搏動(dòng)，就達(dá)到止血目的，最后將時(shí)間標(biāo)簽放在身體的明顯部位，寫(xiě)上上止血帶時(shí)間和放松時(shí)間。止血帶止血法注意事項(xiàng)：