Cav1.2和Cav3.1在犬左心室不同部位中表達(dá)的比較

Cav1.2和Cav3.1在犬左心室不同部位中表達(dá)的比較

【關(guān)鍵詞】腺病毒,犬；電異質(zhì)性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheexpressionsofmRNAofICaLandICaTacrossthecanineleftventricularwallandtoexplorethepossiblemolecularmechanismandsignificanceofelectricalheterogeneity.METHODS:ThemRNAexpressionsoftheICaLαsubunit,ICaTtranscriptwerequantifiedbysemiquantitativeRTPCRintissuesectionsobtainedfromdifferentregionsofcanineleftventricleincludingepicardium(Ep),midmyocardium(M)andendocardium.RESULTS:ThemRNAofwasexpressedmuchmorestronglyinMandinEnthanthatinEp,buttherewasnosignificantdifferencebetweenMandEn().mRNAwasalmostabsentinEp,whilejustalittleinMandEn.CONCLUSION:Thereareconsiderablevariationsofcalciumchannelsacrossthecanieleftventricularwall,whichmaybethemolecularbasisofthedistributionofICaLandICaT,andmayplayanimportantpartintheoccurenceanddrugtreatmentofreentryarrhythmias.

【Keywords】adenoviruses,canine；electricalheterogeneity；RTPCR

【摘要】目的：研究犬左心室三層心肌L型鈣通道、T型鈣通道主要亞單位mRNA的表達(dá)情況，探討其復(fù)極異質(zhì)性的可能分子基礎(chǔ)及意義.方法：應(yīng)用RTPCR半定量分析犬左心室外、中、內(nèi)三層心肌ICaLα亞單位、ICaT主要的亞單位mRNA的表達(dá)量.結(jié)果：mRNA的表達(dá)在左心室中層、內(nèi)層均明顯高于外層，但在中層和內(nèi)層之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異().mRNA在外層幾乎缺如，在中層、內(nèi)層也只有少量表達(dá)且無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異().結(jié)論：，mRNA在犬左心室三層心肌中表達(dá)存在明顯的差異，這種差異可能構(gòu)成左心室三層心肌ICaL及ICaT分布差異的分子基礎(chǔ)，在折返性心律失常的產(chǎn)生及藥物治療中可能起著重要的作用.

【關(guān)鍵詞】腺病毒，犬；電異質(zhì)性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

0引言

近年來(lái)大量的電生理研究證實(shí)，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的左心室存在明顯的跨室壁復(fù)極離散，而且認(rèn)為瞬間外向鉀電流是決定其電異質(zhì)性的一個(gè)重要決定因素，這種復(fù)極異質(zhì)性在某些折返性心律失常的產(chǎn)生中起著重要的作用［1-2］.有報(bào)道［3］認(rèn)為KchIP2基因是決定犬及人類(lèi)左心室Ito異質(zhì)性分布的基礎(chǔ).最近又有研究發(fā)現(xiàn),L型鈣通道(ICaL)和T型鈣通道(ICaT)在犬的左心室也存在明顯的異質(zhì)性分布，并認(rèn)為也是形成左室電異質(zhì)性的一個(gè)重要因素［4］，但構(gòu)成左室ICaL，ICaT異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)尚不甚明確.我們旨在探討ICaL的α亞單位及ICaT的主要亞單位mRNA在犬左心室三層心肌中的表達(dá)情況，以明確其分子基礎(chǔ)及意義.

1材料和方法

材料健康成年雜種犬6只；TaqDNA聚合酶、100bpDNAmarker；DEPC；Trizol；RNasin；dNTPs；瓊脂糖、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、寡聚六核苷酸隨機(jī)引物；PCR儀(PE2480，美國(guó)).

方法

組織總RNA的提取將犬用30g/L戊巴比妥鈉以30mg/kg靜脈注射麻醉后迅速取左心室內(nèi)、中、外層心肌，左心室三層組織定位按如下進(jìn)行［5］:外膜至其下mm為外膜層;外膜下～mm為中層;內(nèi)膜表面至其下mm為內(nèi)膜層.洗凈吸干后置于液氮中保存,用Trizol按一步法分別提取外層、中層、內(nèi)層心肌的總RNA:每100~150mg組織加1mLTrizol,勻漿;加mL氯仿?lián)u勻,12000g離心15min;水相移至新管,加mL異丙醇,12000g離心15min;棄上清,加750mL/L乙醇1mL,清洗,7500g離心5min,無(wú)RNase水溶解RNA.所提的總RNA在A260nm/A280nm為～之間,10g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察18S與28S條帶清晰且密度比值約等于2,并無(wú)基因組污染時(shí)可用.

擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank的序列,參考文獻(xiàn)［6-7］,分別設(shè)計(jì)，及βactin(表1),由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.表1PCR引物序列及PCR反應(yīng)條件

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取2μg總RNA,分別加入隨機(jī)引物μg;加無(wú)RNase水至12μL,混勻后70℃變性5min,迅速冰上冷卻5min.最后加入MMLVbuffer5μL;dNTPs5μL;RNasinμL;MMLV酶1μL并加無(wú)RNase水至使總反應(yīng)體系為25μL.上述混合物在42℃反應(yīng)90min后，置于-20℃保存待用.

擴(kuò)增反應(yīng)取以上逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL,分別加入以下成分:Taqbuffer5μL;dNTPs5μL;特異引物上游1μL、下游1μL;Taq酶μL;加去離子水使整個(gè)反應(yīng)體系為25μL.用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：βactin(內(nèi)對(duì)照)反應(yīng)條件為：起始變性94℃5min,循環(huán)時(shí)94℃30s,55℃30s,72℃45s,共進(jìn)行32輪循環(huán),最后延伸72℃10min.基因反應(yīng)條件為：起始變性94℃5min,循環(huán)時(shí)94℃30s,54℃30s,72℃45s,共進(jìn)行35輪,最后延伸72℃10min.基因反應(yīng)條件為：起始變性94℃5min,循環(huán)時(shí)94℃30s,52℃30s,72℃45s,共進(jìn)行35輪,最后延伸72℃10min.

電泳成像分別將，與βactin等量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μL一起上樣,經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳，用全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)凝膠成像，用ImageTool分析各電泳條帶灰度積分,以βactin的灰度積分作為標(biāo)準(zhǔn)校正.產(chǎn)物的相對(duì)量=電泳條帶灰度積分/βactin電泳條帶灰度積分；產(chǎn)物的相對(duì)量=電泳條帶灰度積分/βactin電泳條帶灰度積分.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x±s表示,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,組間均數(shù)比較用F檢驗(yàn)及q檢驗(yàn),認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

在犬左室三層心肌中的表達(dá)的mRNA表達(dá)在左心室中層、內(nèi)層均明顯高于外層，但在中層和內(nèi)層之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(，圖1，表2).

1:Marker;2:內(nèi)層;3:中層;4:外層.

圖及βactinmRNA在犬左室三層心肌中的表達(dá)

表，mRNA在犬左室三層心肌中的比較

在犬左室三層心肌中的表達(dá)的mRNA表達(dá)在外層幾乎缺如，在中層、內(nèi)層也只有少量表達(dá)且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(，圖2，表2).

3討論

左心室肌存在明顯的電異質(zhì)性現(xiàn)象，內(nèi)層心肌較外層心肌具有更長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程，以往的研究表明Na＋Ca2＋交換電流可能是一個(gè)重要的原因.我們發(fā)現(xiàn)犬的左室三層心肌ICaL，ICaT亞單位mRNA在表達(dá)上存在明顯的不同，在某種程度上與ICaL，ICaT電流密度在三層心肌中的分布一致.正常情況下，心室肌細(xì)胞L型鈣電流開(kāi)放后引起鈣經(jīng)RyR2從肌漿網(wǎng)釋放，實(shí)現(xiàn)心肌的興奮收縮耦聯(lián).ICaL還是心肌細(xì)胞重要的復(fù)極電流，參與2相平臺(tái)形成，是形成心律失常的重要離子流基礎(chǔ).Wang等［4］對(duì)犬左心室肌鈣通道異質(zhì)性研究后發(fā)現(xiàn)，L型鈣電流密度在心內(nèi)膜明顯高于心外膜，并認(rèn)為這是心內(nèi)膜APD明顯大于外膜APD及左心室電異質(zhì)性的一個(gè)主要原因.我們發(fā)現(xiàn)ICaL的α亞單位mRNA在犬的左室三層心肌表達(dá)上存在明顯的差異：外層表達(dá)明顯少于內(nèi)層，而中層和外層幾乎相當(dāng).這種變化在某種程度上與其L型鈣電流密度在上述部位的變化一致，可能是內(nèi)層心肌L型鈣電流密度較大的基礎(chǔ)，也是左室電異質(zhì)性形成的基礎(chǔ)之一.但是有研究［8］表明ICaL的β亞單位能單獨(dú)提高鈣電流密度,因此其β亞

單位在心室肌不同部位的表達(dá)情況還有待進(jìn)一步研究.另外ICaL在心肌中的表達(dá)是否涉及到其他因素的調(diào)控如自主神經(jīng)系統(tǒng)和有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都有待進(jìn)一步研究.

ICaT被認(rèn)為在心臟自律性、細(xì)胞生長(zhǎng)和心血管重塑中起關(guān)鍵性的作用.Wang等［4］研究發(fā)現(xiàn)犬左心室心內(nèi)膜細(xì)胞具有很少的T型鈣電流，而在外膜細(xì)胞ICaT幾乎不出現(xiàn)，并認(rèn)為在左心室壁內(nèi)外膜鈣通道的密度和特性的不同亦可能是整個(gè)跨膜電不均一性的部分原因.已知道，及是編碼心肌T型鈣通道的三種基因，而在左心室肌主要表達(dá)［7］.我們發(fā)現(xiàn)mRNA在犬左心室三層心肌也存在明顯差異：在心內(nèi)膜及中層心肌有少量表達(dá)，在心外膜心肌幾乎沒(méi)有表達(dá).這與T型鈣電流密度在上述部位中的差異在某種程度上一致，可能也構(gòu)成了T型鈣電流密度在內(nèi)層稍大及左室電異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)之一.正常情況下，心室雖存在電異質(zhì)性卻較少有心律失常的發(fā)生，在某些病理情況下電異質(zhì)性增大，因此增強(qiáng)了鈣內(nèi)流的藥物敏感性、易形成早期后除極、延遲后除極及其介導(dǎo)的觸發(fā)活動(dòng)從而導(dǎo)致折返性心律失常的發(fā)生［9］.我們的結(jié)果提示，基因在三層心肌中表達(dá)的差異可能是構(gòu)成上述病理現(xiàn)象的基礎(chǔ).因此進(jìn)一步對(duì)左室心肌電異質(zhì)性及其分子基礎(chǔ)的研究必將為折返性室性心律失常疾病機(jī)制的闡明和治療藥物的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟?gòu)V闊的前景.

【參考文獻(xiàn)】

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［8］