培訓(xùn)一各種引物設(shè)計(jì)演示文稿

培訓(xùn)一各種引物設(shè)計(jì)演示文稿本文檔共26頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分（優(yōu)選）培訓(xùn)一各種引物設(shè)計(jì)本文檔共26頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分基因定義基因組DNAcDNARNA提取本文檔共26頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分1.家族基因。是指具有相同功能的，不同基因。2.轉(zhuǎn)錄本。是指一個(gè)基因有兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄結(jié)果。都來自于一個(gè)基因，由于選擇性剪切導(dǎo)致的。本文檔共26頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分基因擴(kuò)增PCR體系：酶，緩沖液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F，R。Forward,ReF引物R引物本文檔共26頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分流程1.模板準(zhǔn)備，引物準(zhǔn)備2.PCR擴(kuò)增3.片段回收4.連接TA克隆5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌6.測(cè)序，確定序列7.提質(zhì)粒，保存菌液（15%-30%甘油）本文檔共26頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分序列尋找exocytosisCs3g16120參考基因組網(wǎng)站：甜橙（Citrussinensis）。柑橘菌根模式：枳殼（Poncirustrif.），做為砧木，使用范圍最廣，抗寒。苜?；蚪M：/cgi-bin/medicago/overview.cgi?；蜓芯壳闆r。本文檔共26頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分1.枳殼中基因，做亞細(xì)胞定位克隆啟動(dòng)子（用DNA）ATG前2kb，基因序列（用RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA）。2.對(duì)應(yīng)到苜蓿中基因，做RNAi功能驗(yàn)證，熒光定量PCR驗(yàn)證。（用cDNA克?。┍疚臋n共26頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分引物設(shè)計(jì)原則1、長(zhǎng)度：15—30bp，其有效長(zhǎng)度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長(zhǎng)度小于20時(shí)，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3.Tm53-603、堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個(gè)的連續(xù)G或C，否則會(huì)使引物在G十C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。4、引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。7、3’末端：如果可能的話，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少3個(gè)核苷酸。示范。。。最普通的PCR引物設(shè)計(jì)。。。本文檔共26頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)1.Tm60度。2.片段特異性。在基因組上，僅存在這一條片段，只能擴(kuò)出這一條片段。選取3‘UTR區(qū)域。3.片段長(zhǎng)度在60-100bp左右。本文檔共26頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分酶切法構(gòu)建載體本文檔共26頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分1.選擇載體上的酶切位點(diǎn)。保證所需要的基因片段中不包含此酶切位點(diǎn)。2.添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。都添加到引物的5’端。本文檔共26頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分Topo克隆本文檔共26頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分Gateway反應(yīng)本文檔共26頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分RNAi本文檔共26頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分本文檔共26頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分超表達(dá)載體本文檔共26頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期日\12點(diǎn)5分RNAi引物設(shè)計(jì)1.片段長(zhǎng)度：在300-500bp比較好。2.序列必須特異。特異到，20-21bp都