化妝品體外哺乳動物細胞微核試驗2021

驗InVitroMammamlianCellsMicronucleusTest1范圍本方法規(guī)定了體外哺乳動物細胞微核試驗的范圍、試驗?zāi)康摹⒍x、試驗基本原則、試驗材料與試劑、試驗步驟、結(jié)果判定標準。本方法適用于化妝品原料或產(chǎn)品的致突變性的檢測。2試驗?zāi)康谋驹囼炗糜跈z測體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體損傷和非整倍體變異，以評價受試物致突變的可能性。3定義3.1微核micronuclei染色單體或染色體的無著絲粒斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期，無法遷移至兩極而遺留在細胞質(zhì)中末期之后單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。3.2著絲粒centromere染色體中將兩條姐妹染色單體結(jié)合起來的DNA區(qū)域。3.3非整倍體aneuploidy二倍體染色體組中缺少或額外增加一條或若干條完整的染色體的變異類型。3.4非整倍體誘變劑aneugen作用于細胞有絲分裂或者減數(shù)分裂周期，導(dǎo)致細胞分裂異常，誘發(fā)非整倍體的物質(zhì)。3.5染色體斷裂chromosomebreakage染色體臂出現(xiàn)長度大于染色體臂寬度的裂隙。3.6染色體斷裂劑clastogen引起染色體發(fā)生斷裂的物質(zhì)。3.7細胞毒性cytotoxicity對細胞結(jié)構(gòu)或功能的有害效應(yīng)，最終可導(dǎo)致細胞死亡。3.8致突變性mutagenicity導(dǎo)致基因或染色體結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生可遺傳的DNA堿基對序列變化的能力。4試驗基本原則體外哺乳動物細胞微核試驗是一種用于檢測哺乳動物細胞經(jīng)受試物處理后是否產(chǎn)生微核的致突變性檢測方法。本方法適用于檢測有絲分裂細胞暴露于受試物期間或之后致染色體斷裂和/或誘發(fā)非整倍體的能力如果短（3h～6h）處理的試驗結(jié)果為陰性或不明確時，需要進行無代謝活化系統(tǒng)的長處理試（用試物處細胞1.5～2.0個正常細胞周期。試驗分為使用和不使用肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素（CytochalasinBcytoB）兩種方法。方法一：在細胞經(jīng)過受試物處理，有絲分裂前使用cytoB，然后觀察分析已完成一次有絲分裂的細胞（雙核細胞）微核率。方法二：不使用cytoB，細胞經(jīng)過受試物處理后觀察分析細胞微核率。當選用人類淋巴細胞時，建議采用方法一，因為不同來源的細胞周期不同，而且不是所有的細胞都對植物血球凝集素（PH有反應(yīng)如果有證據(jù)表明受試物干擾cytoB的活性，或cytoB可能影響細胞的生（如小鼠淋巴瘤細胞株建議采用方法二。5試驗材料與試劑5.1細胞株可選用中國倉鼠肺細胞（V79或CH、中國倉鼠卵巢細胞（CHO小鼠淋巴瘤細胞（L5178Y、人類淋巴母細胞株（TK）或原代培養(yǎng)細胞。細胞在使用前應(yīng)進行染色體數(shù)目穩(wěn)定性和有無支原體污染的檢查。5.2培養(yǎng)基根據(jù)細胞類型來選擇適宜的培養(yǎng)基對于V79CHL或CHO細胞，常用ME（Eagl）培養(yǎng)液加入10%胎牛血清和適量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL)于L5178Y或TK6用RPMI1640培養(yǎng)液加入10%馬血清和適量抗菌素(可用青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL)。5.3溶液的配制5.3.1是S9混合物（S9mixS9是從經(jīng)酶誘導(dǎo)劑（Aroclor1254或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合用）理嚙動肝獲的S9的制備同細菌回復(fù)突變試驗。S9的使用濃度為1%～10%（終濃度。S9mix中所加輔助因子的量由各實驗室自行決定但需確保S9mix的活性必須能明顯活化陽性對照物也可使用下述方法配制：92S 0.125mLMgCl（0.4mol/）0.02m92l（15L） 2L糖-6-磷酸1.791mg輔Ⅱ（氧化型AP）05g用清ME培養(yǎng)液補足至1。5.3.2 cytoB溶液：用二甲基亞砜（DMSO）配制適當濃度的儲備液，避光冷凍保存。cytoB的終濃度通常為3μg/m～6μg/mL實驗室應(yīng)根據(jù)各種細胞系選擇cytoB的適當終濃度，以達到理想的雙核細胞出現(xiàn)頻率。5.3.30.075mol/L氯化鉀溶液: 5.59g氯化鉀加蒸餾水至1000mL。5.3.4固定液: 甲∶冰醋酸為3∶1（V/，臨用前配制。5.3.5（Giema料3.8g置至375mL溶再加125mL甘油放入37℃溫箱中保溫48h保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，室溫保存，2周后使用作為姬姆薩染液原液使用時取1份姬姆薩染液原液，與9份1/156.8）混合，配成其應(yīng)用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。6.8）配制方法如下：a）第一液：取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.47g溶于去離子水1000mL成溶液；b（H2PO49.07g溶于去離子水L成溶液；c取第一液50mL加于第二液50mL為的1/15磷酸鹽緩沖液。5.4溶劑的選擇溶劑必須是非致突變物不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)不影響細胞存活和S9活性首選溶劑是培養(yǎng)（S培或S時，可選用DMSO作為溶劑，但終濃度不應(yīng)大于0.5%。5.5受試物的濃度選擇及配制5.5.1受試物濃度設(shè)置5.5.1.1劑量設(shè)置：至少應(yīng)設(shè)置3個可供分析的劑量。受試物沒有細胞毒性時，從最高劑量往下設(shè)至少2個劑量，一般情況下間隔系數(shù)可為2～3當受試物有細胞毒性時其劑量范圍應(yīng)涵蓋從50%～60%的細胞毒性到幾乎無細胞毒性。==5.5.1.2 最高劑量的選擇：決定最高劑量的因素是細胞毒性、受試物的溶解度以及pH值、滲透壓。受試物有細胞毒性時，最高劑量應(yīng)能引起50%～60%的細胞毒性；如果沒有細胞毒性或沉淀，最高劑量應(yīng)是5μL/m、5L或L。毒性，則最高劑量應(yīng)是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應(yīng)使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。5.5.1.3在S9存在和不存在兩種條件下依據(jù)細胞完整性和生長情況的指標來確定細胞毒性。方法一：使用cytoB，細胞毒性的確定可依據(jù)復(fù)制指數(shù)（ReplicationIndex，RI）或胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)（CytokinesisBlockProliferationIndex，CBPI。I= ×100數(shù)T+2×I= ×100數(shù)C+2×/500：500為細胞總數(shù)；T=受試物組，C=陰性對照組細胞毒性=100-RII數(shù)

+2×數(shù)+3×）500：CBPI=1等同于100%細胞生長抑制；500為細胞總數(shù)。I-1T性=100-IC-1×100：T=受試物組I-1T方法二：不使用cyto，細胞毒性的確定可依據(jù)相對細胞增長數(shù)（RelativeIncreaseinCellCounts，RIC）或相對增殖倍數(shù)（RelativePopulationDoubling，RP）。C= 100（）C= 100性=100–RICC==

×100：量=g(數(shù)/）/g2性=100-RPD5.5.2受試物的配制：固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至適當濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當濃度。氣體或易揮發(fā)的受試物應(yīng)采用適當方法如用封閉式容器或細胞室。受試物應(yīng)無菌，現(xiàn)用現(xiàn)配，否則須確認儲存不影響其穩(wěn)定性。5.6對照的選擇5.6.1陽性對照物：陽性對照物包括染色體斷裂劑和非整倍體劑。加S9時，斷裂劑可以選用環(huán)磷酰胺（CAS號：50-18-0（CAS號50-32-8加S9劑（CAS號147-94-4素（S號50-07-7（S66-27-3和4-硝基喹（CAS號56-57-5加S9以選用秋水仙素（CAS號：64-86-8）和長春堿（CAS號：143-67-9。如果短期處理試驗方案在S9存在和不存在兩種條件下都選用斷裂劑作為陽性對照，那么長期處理試驗方案應(yīng)該選用非整倍體劑作為陽性對照。如果選用的細胞本身具有代謝加S9劑和非整倍體劑。5.6.2 陰性對照物：應(yīng)設(shè)陰性對照（溶劑，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其他處理和受試物組完全相同。此外，如未能證實所選溶劑不具有致突變性，溶劑對照與本實驗室空白對照背景資料有明顯差異，還應(yīng)設(shè)空白對照。6 試驗步驟6.1 細胞準備：將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，以收獲細胞時培養(yǎng)皿（瓶）的細胞未長滿為標準，貼壁細胞一般以長到85%左右為佳。6.2受試物處理6.2.1方法一：使用cytoB吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗細胞，加入無血清培養(yǎng)液及一定濃度的受試物（需代謝活化者同時加入S9mix，置于培養(yǎng)箱中3h～6h；結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液用PBS洗細胞2次以上加入含10%血清的新鮮培養(yǎng)液和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)至1.5～2.0個正常細胞周期（從加入受試物開始計算）后收集細胞。對于淋巴細胞最有效的方法是在有絲分裂（如PHA）刺激后44h～48h開始受試物處理，這時細胞開始進入分裂周期。如果短期（3h～6h）處理的試驗結(jié)果為陰性或不明確無S9的長期處理試驗，用cytoB和受試物處理細胞1.5～2.0個正常細胞周期，在處理結(jié)束后收集細胞。如果已知或懷疑受試物（如核苷類物質(zhì)）可能影響細胞周期（特別是P53活性細胞，則細胞收獲時間應(yīng)該再延長1.5～2.0個正常細胞周期。6.2.2方法二：不使用cytoB與6.2.1處理方法相同，只是不加cytoB。6.3收獲細胞與制片每次培養(yǎng)都應(yīng)單獨收獲細胞和制片。6.3.1消化：貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待含10%胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以800r/min～1000r/min的速度離心5min離心。6.3.2低滲：加入0.075mL氯化鉀溶液2mL，用滴管將細胞輕輕地吹打混勻37℃低滲處理1min～5mn細胞混合液的分散度良好則不需要進行低滲處理。6.3.3固定加入2mL固定液混勻后固定5min以上，以800r/min～1000r/min的速度離心5mi，棄去上清液。相同步驟，重復(fù)一次。6.3.4 滴片：加入數(shù)滴固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。6.3.5染色推薦用姬姆薩染（5%～10%姬姆薩染液，1in～20min用DNA橙或Hoechst33258。如果需要區(qū)分染色體斷裂劑和非整倍體誘變劑可用熒光原位雜（FISH或引物原位標記等方法。6.4閱片6.4.1微核的判斷標準微核一般為圓形或橢圓形；直徑不超過主核的1/3；與主核在一個焦點平面上，與主核的顏色、結(jié)構(gòu)特征及折光性一致；與主核之間沒有核物質(zhì)相連，可以和主核有邊界的重疊，但能看清各自的核膜。6.4.2方法一：使用cytoB每個劑量組至少分析2000個雙核細胞，計算微核細胞率（一個雙核細胞不論含有幾個微核，都只算作一個含微核細胞。如果單次培養(yǎng)可供計數(shù)的雙核細胞數(shù)少于2000，則應(yīng)采用多次細胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)，以獲得足夠分析的細胞。對不規(guī)則的雙核細胞（如兩個核大小相差懸殊）和多于兩個核的細胞不進行分析。6.4.3方法二：不使用cytoB每個劑量組至少分析2000個細胞，計算微核細胞率。如果單次培養(yǎng)可供計數(shù)的細胞數(shù)少于2000則應(yīng)采用多次細胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)。6.5統(tǒng)計處理：數(shù)據(jù)按不同劑量列表指標包括細胞毒性觀察細胞數(shù)、含微核細胞數(shù)及微核細胞