第二章蛋白質的定性定量分析

第二章蛋白質的定性定量分析課件第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四

蛋白質定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質存在，以及存在的是何種蛋白質

蛋白質定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四

蛋白質含量的測定方法（重點掌握）

蛋白質相對分子量測定(SDS)

等電聚焦電泳(IEF)（一般了解）

蛋白質的免疫印跡分析

(westernblot)第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四第一章蛋白質的含量測定蛋白質的含量測定基于蛋白質的元素組成特點基于蛋白質的化學顯色反應基于蛋白質的光吸收特性第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四

蛋白質元素組成的特點各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質的大致含量：100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四一、紫外光譜(A280)吸收法

這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質成分。通常用于柱層析過程中檢測蛋白質的洗脫峰第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四優(yōu)點快速缺點核酸可引起強干擾作用芳香族氨基酸含量差異可以起誤差對蛋白質無破壞性不是嚴格的定量，適用于測定蛋白質粗提液第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四計算方法標準曲線法蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項石英比色杯調零所用溶液配制標準蛋白所用溶液光密度范圍第九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四二、考馬斯亮藍G-250檢測法

這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質含量的方法第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四原理

該法是基于考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)。藍色復合物在595mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四所需時間10min優(yōu)點快速（反應時間僅需2min）敏感，幾乎沒有蛋白質損失缺點用這種測定方法對蛋白質引起不可逆的變性對各種純化蛋白質反應不同第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四計算方法標準曲線法注意事項反應10～15min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四三、Lowry檢測法

這一標準、快速的蛋白質定量檢測方法已得到廣泛應用.第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四原理

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四優(yōu)點一種可靠的蛋白質定量方法不同蛋白質之間差別很小缺點某些試劑不穩(wěn)定干擾物質多使蛋白質發(fā)生不可逆變性第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四計算方法標準曲線法注意事項在加入試劑30min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱許多干擾物質降低顏色反應高鹽濃度可引起沉淀第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四四、BCA(二喹啉甲酸)檢測法

這是近年來新研制的一種改進的Lowry測定法第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四原理

在堿性環(huán)境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質的含量第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四優(yōu)點檢測敏感性高缺點蛋白質發(fā)生不可逆的變性終產物穩(wěn)定巰基試劑和去垢劑干擾第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四第二節(jié)蛋白質相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)排阻層析沉降平衡超速離心動態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質譜(ESI-MS)第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四一、SDS測定蛋白質的相對分子量1.不連續(xù)系統(tǒng)原理2.SDS凝膠的制備制備分離膠制備濃縮膠加樣裝板電泳卸板并進行凝膠染色第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四3.SDS基本原理SDS

影響遷移率的因素

十二烷基硫酸鈉

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸鈉

(SodiumDodecylSulfonate)

第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四SDS作用：與蛋白牢固結合，當其濃度大于1mmol/L時，SDS與蛋白質的結合比例為1.4gSDS/1g蛋白質，由于十二烷基硫酸根帶負電荷，使得樣品中各種蛋白質與SDS形成的SDS-蛋白質復合物都帶有相同密度的負電荷，掩蓋了蛋白質分子間天然的電荷差異第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四SDS-蛋白質復合物分子構型也幾乎相同(雪茄煙形的長橢圓棒狀的復合物)，而且具有相同的荷質比，因此在SDS中，SDS-蛋白質復合物的電泳遷移率只與其分子量有關，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對數(shù)線性關系WatchSDS原理第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四4.SDS測定分子量的操作標準品的選擇及處理待測樣品的制備電泳分離及染色相對遷移率的計算WatchSDS操作第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四AnalysisforSDSelectrophoresis第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四5.注意事項選擇合適的膠濃度樣品中高濃度的陽離子可能會導致SDS的沉淀，應在加入樣品緩沖液之前將其除去SDS與蛋白質之間的結合程度蛋白質的分子量范圍15～200KD之間二硫鍵是否完全被還原溶液中SDS的濃度溶液的離子強度第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四多亞基蛋白質分子量檢測用其它方法測定分子量進行參照SDS和巰基乙醇SDS測定的準確性電荷異?；驑嬒螽惓в休^大輔基的蛋白質某些結構蛋白第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四二、凝膠過濾層析測定蛋白質的相對分子量1.基本原理2.凝膠過濾測定分子量的操作分子篩效應洗脫體積與相應分子量的關系裝柱平衡加樣平衡洗脫收集樣品并計算Ve繪制標準曲線第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四3.注意事項柱床表面不能干燥凝膠的選擇Sephadex溶脹G值的意義凝膠柱的再生與保存第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四第三節(jié)

等電聚焦電泳測定蛋白質的等電點第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四等電點(isoelectricpoint,pI)兩性電解質性質支持介質(supportingmedia)FigureofIEF第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusing第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四ReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mm第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四BroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRangepH4.7-5.931044774.75.94.75.9第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四注意事項兩性電解質的選擇電極緩沖液對樣品的要求樣品必須無鹽加樣的量要適當加樣方法加樣位置第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四第四節(jié)

蛋白質的免疫印跡分析第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四

印跡技術(blotting)是指將存在于凝膠中的生物大分子轉移（印跡）于或直接放在固定化介質上并加以檢測分析的技術1975年，EdwenSouthern提出了分子印跡(漬)的概念目前這種技術已被廣泛用于DNA、RNA和蛋白質的檢測第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四印跡技術的類別及應用

DNA印跡技術(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析

RNA印跡技術(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析

蛋白質的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究由于蛋白質常用抗體來檢測，因此也被稱為免疫印跡技術(immunoblotting)第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四一、免疫印跡分析的應用對蛋白質進行定性分析對蛋白質進行半定量分析信號轉導分析生物大分子相互作用分析第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四將蛋白質固定在膜上的其他應用

結構域分析斑點印跡抗體純化為制備抗體時獲得相應的蛋白質抗原蛋白質鑒定：氨基酸組成分析和序列分析第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四二、免疫印跡分析的基本流程

電泳分離蛋白

轉移至固相膜

封閉非特異結合位點

與第一抗體溫育反應

與第二抗體交聯(lián)物溫育反應

顯色制備蛋白樣品蛋白質轉移抗體檢測第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四免疫印跡操作流程圖第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四1.樣品的制備

組織或細胞中提取

裂解

去污劑(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制劑(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白質的定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程表達重組產物第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四2.電泳分離

SDS非變性PAGEEIF第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四3.蛋白質的電轉移方法：半干法、濕法作用：將凝膠上的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上注意：在疊放硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠時，膜與膠之間要緊密貼在一起，中間不能有任何氣泡??？第四十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四常用的蛋白質轉移膜種類微孔大小結合能力特點NC膜0.45um80-100ug/cm2應用廣泛<20kD易丟失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丟失容量大、強度高尼龍膜480ug/cm2用于核酸第四十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四電轉移裝置第五十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四電轉移示意圖第五十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期四電轉移裝置第五十二頁，共五十七頁，編輯于2023年