基因重組和基因工程

目的要求熟悉DNA重組的類型：同源重組、特異位點重組和轉座重組等。熟悉同源重組、特異位點重組、轉座、插入序列和轉座子、接合作用、轉化作用和轉導作用的概念；細菌的基因轉移的方式。掌握重組DNA技術的相關概念：重組DNA技術的基本原理和過程；目的基因的概念及種類。熟悉限制性內切核酸酶的概念、識別位點及切割產生的末端；目的基因的獲取途徑；外源基因與載體的連接方式；重組DNA導入受體菌的方式；重組體的篩選方法。本文檔共116頁；當前第1頁；編輯于星期二\12點36分1

自然界DNA重組和基因轉移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第一節(jié)本文檔共116頁；當前第2頁；編輯于星期二\12點36分2什么是DNA重組？DNA分子內或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合。DNA片段在細胞內、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能本文檔共116頁；當前第3頁；編輯于星期二\12點36分3DNA重組廣泛存在于各類生物：真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。原核生物來自不同親代兩組DNA之間可通過多種形式遺傳重組。意義：迅速增加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學過程本文檔共116頁；當前第4頁；編輯于星期二\12點36分4DNA重組的分類轉座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)本文檔共116頁；當前第5頁；編輯于星期二\12點36分5概念：發(fā)生在同源序列間的重組，通過鏈的斷裂（,配對）和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段交換的過程。又稱基本重組（generalrecombination)。是最基本的DNA重組方式一、同源重組是最基本的DNA重組方式指在同一物種不同個體間或不同物種間相同或相似的DNA序列

本文檔共116頁；當前第6頁；編輯于星期二\12點36分6同源重組最初的證據(jù)來自細胞遺傳學對減數(shù)分裂時染色體行為的研究。真核生物在形成配子時，細胞染色體進行一次復制，細胞核進行兩次分裂，由此從雙倍體細胞產生單倍體細胞，故稱減數(shù)分裂。前期，參與聯(lián)會的同源染色體實際上已復制形成兩條姊妹染色體，從而出現(xiàn)有四條染色體構成的四聯(lián)體。在四聯(lián)體的某些位置非姊妹染色單體之間可以發(fā)生交換。本文檔共116頁；當前第7頁；編輯于星期二\12點36分7同源重組機制—Holliday模型（1）兩個同源染色體DNA排列整齊（任意兩個同源DNA片斷可以發(fā)生重組，但同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，方能交換）。

ＡＢＣＡ′B′C′

a′b′c′abc1234

本文檔共116頁；當前第8頁；編輯于星期二\12點36分8（2）一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′（3）通過分支移動產生異源雙鏈DNA，形成Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′本文檔共116頁；當前第9頁；編輯于星期二\12點36分9片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)（4）Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：本文檔共116頁；當前第10頁；編輯于星期二\12點36分105′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶片段重組體5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)5′3′5′5′5′3′3′3′拼接重組體5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′本文檔共116頁；當前第11頁；編輯于星期二\12點36分11片段重組體

（見模型圖右邊產物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

本文檔共116頁；當前第12頁；編輯于星期二\12點36分12本文檔共116頁；當前第13頁；編輯于星期二\12點36分13參與E.coli同源重組的主要酶RecA蛋白：結合單鏈DNA，形成的復合物，復合物可將同源雙螺旋中的互補順序“退火”，同時將另一條鏈排擠出去，形成所謂D環(huán)RecBCD：具有三種酶活性：①DNA解旋酶；②核酸外切酶；③單鏈內切酶的活性。RuvC：特異的識別Holliday分支點，并改變DNA在Holliday分支點處的構型，將兩條單鏈切斷，隨后由連接酶將切口連接.本文檔共116頁；當前第14頁；編輯于星期二\12點36分14

內切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移(recA)

內切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′本文檔共116頁；當前第15頁；編輯于星期二\12點36分15Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體本文檔共116頁；當前第16頁；編輯于星期二\12點36分16①不需要特異DNA序列，而是依賴兩個分子間序列的相同或相似性（同源性）；②同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，相對應方才能交換（聯(lián)會）③重組時，兩個DNA片段必須有一個發(fā)生斷裂或有一段單鏈缺失（空隙）。同源重組特點：本文檔共116頁；當前第17頁；編輯于星期二\12點36分17二、細菌的基因轉移與重組有四種方式細菌可以通過多種途徑進行細胞間基因轉移，并通過基因重組適應隨時改變的環(huán)境。這種遺傳信息的流動不僅發(fā)生在種內，也發(fā)生在種間如果被轉移基因與內在基因部分同源就可以發(fā)生同源重組本文檔共116頁；當前第18頁；編輯于星期二\12點36分18（一）接合作用當細菌的細胞通過性菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞轉移至另一細胞的過程稱為接合作用(conjugation)。細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子?？勺灾鲝椭乒w細胞被定義為雄性受體細胞被定義為雌性本文檔共116頁；當前第19頁；編輯于星期二\12點36分19能夠促使DNA轉移的質粒稱為致育因子，F(xiàn)因子(Ffactor)與接合功能有關的蛋白質（性菌毛等）均由F因子編碼。本文檔共116頁；當前第20頁；編輯于星期二\12點36分20本文檔共116頁；當前第21頁；編輯于星期二\12點36分21本文檔共116頁；當前第22頁；編輯于星期二\12點36分22F質粒DNA可以通過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株若F質粒的DNA未能完整地進入受體菌，則受體菌不能轉化為F+F質粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子，F(xiàn)?因子攜帶的基因可在受體菌表達。本文檔共116頁；當前第23頁；編輯于星期二\12點36分23（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細菌獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉化作用(transformation)。本文檔共116頁；當前第24頁；編輯于星期二\12點36分24具有攝取周圍環(huán)境中游離DNA分子能力的細菌稱為感受態(tài)細胞很多細菌在自然條件下就有吸收外源DNA的能力（如固氮菌、鏈球菌等），雖然感受態(tài)經(jīng)常是瞬間的。本文檔共116頁；當前第25頁；編輯于星期二\12點36分25自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質參與實驗室：高濃度的Ca2+處理使細菌形成感受態(tài)本文檔共116頁；當前第26頁；編輯于星期二\12點36分26①.游離DNA與細胞表面DNA結合蛋白結合，②.其中一股鏈被核酸酶降解，另一股鏈被吸收本文檔共116頁；當前第27頁；編輯于星期二\12點36分27本文檔共116頁；當前第28頁；編輯于星期二\12點36分28（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（受體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。通過噬菌體（病毒）將細菌（細胞）基因從供體轉移到受體本文檔共116頁；當前第29頁；編輯于星期二\12點36分29λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)本文檔共116頁；當前第30頁；編輯于星期二\12點36分30

本文檔共116頁；當前第31頁；編輯于星期二\12點36分31轉導過程本文檔共116頁；當前第32頁；編輯于星期二\12點36分32（四）細胞融合細胞質膜融合導致基因轉移、重組實驗室：溶菌酶除細菌細胞壁，人工促使原生質體融合，引起廣泛的重組。本文檔共116頁；當前第33頁；編輯于星期二\12點36分33三、位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。原核生物中，有時基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會，重組只限于該小范圍內，只涉及特定位點的同源區(qū)，這類重組稱作～本文檔共116頁；當前第34頁；編輯于星期二\12點36分34本文檔共116頁；當前第35頁；編輯于星期二\12點36分35λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合本文檔共116頁；當前第36頁；編輯于星期二\12點36分36（二）細菌的特異位點重組如果一個DNA分子上兩個特異位點之間發(fā)生重組，其后果有兩種可能性：即兩個位點之間的節(jié)段或被丟失，或被顛倒。倘若基因重組發(fā)生在調節(jié)基因或基因調控區(qū)，就會影響某些基因的“開關”機制。有些生物能夠利用這種重組倒置來控制基因的表達。本文檔共116頁；當前第37頁；編輯于星期二\12點36分37①兩端各有一個14bp的反向重復序列（特異重組位點-hix），二者方向相反。②中間是hin基因，編碼特異的重組酶-倒位酶，催化H片段倒位重組。③hin基因兩端各有一個啟動子（P)，其中一個啟動子啟動hin基因表達產生倒位酶，另一個啟動子正向啟動鄰近的H2和rH1基因表達，分別產生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制遠方H1基因的表達。因而結果是H2表達而H1不表達。H片段的組成和功能：本文檔共116頁；當前第38頁；編輯于星期二\12點36分38沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變。本文檔共116頁；當前第39頁；編輯于星期二\12點36分39hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。本文檔共116頁；當前第40頁；編輯于星期二\12點36分40H2鞭毛素阻遏蛋白Hin轉位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變本文檔共116頁；當前第41頁；編輯于星期二\12點36分41四、轉座重組大多數(shù)基因在基因組內的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列可以分為：插入序列和轉座子兩類。由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。本文檔共116頁；當前第42頁；編輯于星期二\12點36分42轉座子中包含一些基因，這些基因可以使轉座子從原來的DNA鏈位置上斷裂開來，然后再插入到另外的DNA鏈位置上。當插入到一個新的位置后，轉座子對附近基因的功能會造成一定的影響，在離開該位置時，它又有可能把一些附近的基因也一起帶走。轉座子的這種行為有點“唯我獨尊”，是基因的自私性的一種表現(xiàn)。本文檔共116頁；當前第43頁；編輯于星期二\12點36分43插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉座二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列一個轉座酶（transposase)編碼基因本文檔共116頁；當前第44頁；編輯于星期二\12點36分44插入序列發(fā)生轉座的形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)當插入序列轉座時，宿主靶部位雙鏈被交錯切開，經(jīng)修復后形成短的正向重復靶序列通常是任意的但交錯切開的長度是固定的。本文檔共116頁；當前第45頁；編輯于星期二\12點36分45插入序列的復制性轉座本文檔共116頁；當前第46頁；編輯于星期二\12點36分46轉座子(transposons)—可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座轉座子組成：

反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因本文檔共116頁；當前第47頁；編輯于星期二\12點36分47細菌的可流動性元件A插入序列：轉座酶編碼基因兩側連接反向末端重復序列(箭頭所示)B轉座子Tn3：含有轉座酶、β-內酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L本文檔共116頁；當前第48頁；編輯于星期二\12點36分48由轉座子介導的轉座本文檔共116頁；當前第49頁；編輯于星期二\12點36分49第二節(jié)

重組DNA技術

又稱DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone本文檔共116頁；當前第50頁；編輯于星期二\12點36分50重組DNA技術的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗。1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。本文檔共116頁；當前第51頁；編輯于星期二\12點36分51一、重組DNA技術相關概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆本文檔共116頁；當前第52頁；編輯于星期二\12點36分52技術水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克隆）

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

本文檔共116頁；當前第53頁；編輯于星期二\12點36分53應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆本文檔共116頁；當前第54頁；編輯于星期二\12點36分54生物技術工程:基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。本文檔共116頁；當前第55頁；編輯于星期二\12點36分55（二）工具酶

限制性核酸內切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶本文檔共116頁；當前第56頁；編輯于星期二\12點36分56重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基本文檔共116頁；當前第57頁；編輯于星期二\12點36分57限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：本文檔共116頁；當前第58頁；編輯于星期二\12點36分58與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）分類：作用：本文檔共116頁；當前第59頁；編輯于星期二\12點36分59Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG本文檔共116頁；當前第60頁；編輯于星期二\12點36分60BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口本文檔共116頁；當前第61頁；編輯于星期二\12點36分61來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：本文檔共116頁；當前第62頁；編輯于星期二\12點36分62有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶本文檔共116頁；當前第63頁；編輯于星期二\12點36分63名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內切核酸酶本文檔共116頁；當前第64頁；編輯于星期二\12點36分64（三）目的基因(targetgene)cDNA(complementaryDNA)指經(jīng)反轉錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應可合成雙鏈cDNA?；蚪MDNA(genomicDNA)指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。本文檔共116頁；當前第65頁；編輯于星期二\12點36分65（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA本文檔共116頁；當前第66頁；編輯于星期二\12點36分66克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。本文檔共116頁；當前第67頁；編輯于星期二\12點36分67載體的選擇標準：能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。本文檔共116頁；當前第68頁；編輯于星期二\12點36分68質粒

(plasmid)特點:能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。本文檔共116頁；當前第69頁；編輯于星期二\12點36分69本文檔共116頁；當前第70頁；編輯于星期二\12點36分70

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列本文檔共116頁；當前第71頁；編輯于星期二\12點36分71本文檔共116頁；當前第72頁；編輯于星期二\12點36分72酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他本文檔共116頁；當前第73頁；編輯于星期二\12點36分73二、重組DNA技術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

本文檔共116頁；當前第74頁；編輯于星期二\12點36分74以質粒為載體的DNA克隆過程本文檔共116頁；當前第75頁；編輯于星期二\12點36分75（一）目的基因的獲取化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列?；蚪MDNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)本文檔共116頁；當前第76頁；編輯于星期二\12點36分76化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。本文檔共116頁；當前第77頁；編輯于星期二\12點36分77組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因本文檔共116頁；當前第78頁；編輯于星期二\12點36分78限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫本文檔共116頁；當前第79頁；編輯于星期二\12點36分79mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT本文檔共116頁；當前第80頁；編輯于星期二\12點36分80（二）克隆載體的選擇和構建目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方法也不同。本文檔共116頁；當前第81頁；編輯于星期二\12點36分81（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接本文檔共116頁；當前第82頁；編輯于星期二\12點36分82BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接本文檔共116頁；當前第83頁；編輯于星期二\12點36分83不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。本文檔共116頁；當前第84頁；編輯于星期二\12點36分84平端連接

限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：本文檔共116頁；當前第85頁；編輯于星期二\12點36分85目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連本文檔共116頁；當前第86頁；編輯于星期二\12點36分86在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。同聚物加尾連接本文檔共116頁；當前第87頁；編輯于星期二\12點36分875′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′本文檔共116頁；當前第88頁；編輯于星期二\12點36分88由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭(linker)連接本文檔共116頁；當前第89頁；編輯于星期二\12點36分89人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ本文檔共116頁；當前第90頁；編輯于星期二\12點36分90受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式：轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌本文檔共116頁；當前第91頁；編輯于星期二\12點36分911.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選本文檔共116頁；當前第92頁；編輯于星期二\12點36分921.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選本文檔共116頁；當前第93頁；編輯于星期二\12點36分93(插入失活法)抗藥性標記選擇本文檔共116頁；當前第94頁；編輯于星期二\12點36分94α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18本文檔共116頁；當前第95頁；編輯于星期二\12點36分95

原位雜交本文檔共116頁；當前第96頁；編輯于星期二\12點36分96

Southern印跡本文檔共116頁；當前第97頁；編輯于星期二\12點36分97雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法本文檔共116頁；當前第98頁；編輯于星期二\12點36分98重組DNA技術操作過程可形象歸納為：小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉轉入受體細胞篩篩選重組體

本文檔共116頁；當前第99頁；編輯于星期二\12點36分99熟悉蛋白質的分子組成特點；氨基酸的化學結構、分類、三字符號及理化性質；肽及多肽鏈的兩端；谷胱甘肽。掌握蛋白質一至四級結構的概念、要點、主要化學鍵及模體(motif)、結構域(domain)、分子伴侶(chaperon)的概念。掌握蛋白質重要的理化性質。熟悉蛋白質分離和純化的方法及其原理。本文檔共116頁；當前第100頁；編輯于星期二\12點36分100掌握核酸的分類、生物學功能、分子組成、化學結構特點。掌握核酸一級結構的概念及連接鍵。掌握DNA的堿基組成及Chargaff規(guī)則、DNA的雙螺旋結構要點。熟悉DNA的超螺旋結構、核小體的組成。掌握RNA的分類、mRNA的結構特點、tRNA一級結構及二級結構的特點、rRNA的功能。掌握DNA的變性、DNA的復性及分子雜交。本文檔共116頁；當前第101頁；編輯于星期二\12點36分101掌握酶的概念。熟悉酶的分子組成：全酶的組成、輔酶與輔基、金屬離子的作用、維生素構成的輔酶與輔基。掌握酶活性中心的概念、活性中心的必須基團。掌握酶促反應的特點：高效性、特異性、可調節(jié)性。掌握影響酶的反應動力學因素、米-曼氏方程式、Km與Vm的意義、酶的最適溫度、最適pH、可逆性抑制作用的概念、類型及其特點。熟悉不可逆性抑制作用的概念、類型及其特點。掌握酶原及酶原激活的概念、酶共價修飾的概念、同工酶的概念及特點。熟悉酶原激活的機理；酶的變構調節(jié)；化學修飾調節(jié)的特點；乳酸脫氫酶同工酶的種類、分布、功能及臨床意義。本文檔共116頁；當前第102頁；編輯于星期二\12點36分102重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交本文檔共116頁；當前第103頁；編輯于星期二\12點36分103表達體系的建立：表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達