兔瘟組織滅活苗的制作

流行病學診斷臨床診斷病理診斷本文檔共24頁；當前第1頁；編輯于星期一\23點49分

微生物(Microorganism)形體微小、結構簡單，須借助于光學顯微鏡或電子顯微鏡進行觀察。病毒(包括噬菌體)；細菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體等；真菌：包括酵母菌（單細胞）、霉菌（多細胞）；單細胞的藻類以及原生動物等?！羌毎臀⑸铩鷨渭毎宋⑸铩婧宋⑸锉疚臋n共24頁；當前第2頁；編輯于星期一\23點49分

細菌(bacteria)的細胞形態(tài)

1、球菌單獨存在時為圓球形，幾個細菌聯(lián)在一起時其接觸面稍為扁平。按其分裂方向和分裂后排列狀態(tài)，可以分為：單球菌、雙球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌、鏈球菌、葡萄球菌。2、桿菌

細胞呈桿狀或圓柱狀，各種桿菌的長度與直徑比例差異很大，有的粗短，有的細長，短桿菌近似球狀，長桿菌近似絲狀。一般來說，同一種桿菌其粗細比較穩(wěn)定，而長度則經(jīng)常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不同而有較大變化。有的桿菌很直，有的稍彎，有的兩端截平如炭疽芽孢桿菌，有的略尖，有的半圓。本文檔共24頁；當前第3頁；編輯于星期一\23點49分

（三）革蘭氏染色

革蘭氏染色法于1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立，是延用至今的經(jīng)典染色法。經(jīng)革蘭氏染色后可以把全部細菌分為G+和G-兩大類。

染色機制：與細菌細胞壁的結構和組成有很大關系。

G+細菌：肽聚糖層厚，含量多，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結晶紫與碘的復合物保留在細胞內(nèi)而不被脫色，復染后不著色，保持結晶紫的顏色；

G-細菌：肽聚糖層很薄，含量少，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細胞壁脂類可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細胞壁孔徑變大或通透性增加，不能阻止溶劑透入，酒精將結晶紫與碘的復合物洗脫，細菌被脫色，經(jīng)復染后染成紅色。

本文檔共24頁；當前第4頁；編輯于星期一\23點49分細胞壁革蘭氏陽性菌(G+)革蘭氏陰性菌(G-)厚度與強度厚、致密、堅韌薄、疏松肽聚糖數(shù)量、含量多層、含量高、占細胞干重40—90%單層、含量低、占細胞干重5—10%脂類含量少、占細胞干重1-4%多、占細胞干重11-22%磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖脂蛋白磷壁酸外膜本文檔共24頁；當前第5頁；編輯于星期一\23點49分染色操作步驟—涂片固定滴生理鹽水挑取菌苔一環(huán)涂片熱固定干燥取菌液一環(huán)涂片干燥本文檔共24頁；當前第6頁；編輯于星期一\23點49分革蘭氏染色法1.涂片、干燥及固定2.

初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1-2分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4.脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約25秒，后立即用流水沖洗。5.復染：滴加番紅染色液，染2分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6.

鏡檢：觀察染色結果圖。本文檔共24頁；當前第7頁；編輯于星期一\23點49分細水沖洗結晶紫初染2min碘液媒染1min95%酒精脫色20s蕃紅復染1~2min細水沖洗細水沖洗本文檔共24頁；當前第8頁；編輯于星期一\23點49分

革蘭氏染色成敗關鍵：酒精脫色，脫色不夠將G-轉變?yōu)镚+，脫色過度將G+變成G-；涂片要均勻、??；菌齡影響染色，菌齡老、陳舊的細菌培養(yǎng)物，往往G+轉變成G-，一般做革蘭氏染色用18小時左右的細菌培養(yǎng)物，不要超過24小時，以免影響染色性。本文檔共24頁；當前第9頁；編輯于星期一\23點49分油鏡操作規(guī)程1.先用低倍鏡和高倍鏡觀察涂片，待看到目的物后，將其移到視野中央。

2.在涂片上滴一滴香柏油，轉動換轉器使油鏡針對通光孔。

3.使油鏡與香柏油接觸，這時油鏡頭幾乎與載玻片相接觸，切記不能使用粗調，以免壓碎載玻片。

4.用細調旋鈕慢慢提升鏡頭高度，直至物像清晰。切勿擰反方向。5.觀察完畢后，使鏡筒遠離載物臺。取下載玻片。用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油：先用干的擦鏡紙擦1～2次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦2次，最后再用干擦鏡紙擦1次。擦拭時要順鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周擦。擦拭要細心，動作要輕。本文檔共24頁；當前第10頁；編輯于星期一\23點49分五、結果：繪模式種、自選種鏡檢油鏡視野圖（比例、形狀準確，注放大倍數(shù)，染色特性）G+(金黃色葡萄球菌)G-（枯草芽孢桿菌）G-（大腸桿菌）本文檔共24頁；當前第11頁；編輯于星期一\23點49分GramStainof

StaphylococcusaureusGramStainof

EscherichiacoliAGramStainofaMixtureofGram-PositiveandGram-NegativeBacteria.本文檔共24頁；當前第12頁；編輯于星期一\23點49分

兔病毒性出血癥的診斷及其組織滅活苗的制造王海榮本文檔共24頁；當前第13頁；編輯于星期一\23點49分

兔的病毒性出血癥（rabbitviralhemorrhagicdiseaze）是兔的一種急性敗血性傳染病，RHDV抗原性強，組織滅活苗效果極佳，安全可靠，目前廣泛使用的是肝組織甲醛滅活苗，聯(lián)苗兔瘟、巴氏桿菌二聯(lián)苗也已使用。本文檔共24頁；當前第14頁；編輯于星期一\23點49分

組織滅活苗可分加佐劑和不加佐劑兩種。含佐劑苗所產(chǎn)生的抗體水平較高于無佐劑苗，但產(chǎn)生免疫力的時間遲于無佐劑苗，而且生產(chǎn)程序較為復雜，成本也高。

當發(fā)生免瘟時，作為緊急接種，選用無佐劑苗更為理想，因產(chǎn)生免疫力較快，可提早控制疫情，即使平時預防接種，無佐劑苗也極為有效。本文檔共24頁；當前第15頁；編輯于星期一\23點49分一

材料

（1）種毒強毒株組織毒1:10懸液感染成兔肌注1ml，48～72小時引起發(fā)病死亡。（2）制苗動物

3月齡以上未感染本病和未接種本病疫苗的健康免。

⑶組織搗碎機等本文檔共24頁；當前第16頁；編輯于星期一\23點49分

二、操作方法1、攻毒取種毒2-5g制成1:10組織懸液，每毫升各加青鏈霉素1000IU單位,在4℃處理4～6小時，取上清液皮下或肌肉注射兔子，1ml/只，實驗免接毒后的觀察。本文檔共24頁；當前第17頁；編輯于星期一\23點49分（1）抗生素可先配制成高濃度的原液，

-20℃保存。（2）抗生素的最高使用濃度。青霉素鉀1萬單位/ml鏈霉毒鉀：20mg/ml即1mg=1000Iu2萬Iu/ml。抗生素的配置：1先配濃溶液20萬/ml，25萬/ml本文檔共24頁；當前第18頁；編輯于星期一\23點49分2、RHD的臨床診斷及實驗室診斷

臨床上，RHD以神經(jīng)癥狀為主，在免疫壓力可表現(xiàn)出非典型變化。剖檢以呼吸系統(tǒng)的嚴重出血和內(nèi)臟實質器官的淤血腫大為特征。人工感染后的發(fā)病高峰時間接種后36～72小時。本文檔共24頁；當前第19頁；編輯于星期一\23點49分

RHDV可凝集人的O型紅細胞，溫度對血凝無顯著影響，PH4.4-7.2時血凝穩(wěn)定，血凝具有特異性，能被高免血清所抑制。

本文檔共24頁；當前第20頁；編輯于星期一\23點49分

10%肝懸液4000rpm，10-15分鐘離心后取上清，1%人O型紅細胞做HA，放置20-30分鐘出結果，血凝現(xiàn)象的觀察時間不超過45分鐘。

HA≥1︰160即為陽性

陽性病料無論是自然死亡還是人工感染致死，其血凝價一般不低于25。

健康兔只有22～23，＜24。本文檔共24頁；當前第21頁；編輯于星期一\23點49分RHD組織滅活苗的制造與檢驗

病料：PBS=1:10，生理鹽水也可。搗碎、濾過，加入甲醛，使之含0.4%，37℃12—24小時，搖勻/2小時。

用0.8%甲醛生理鹽水對倍稀釋，分裝，37℃溫箱內(nèi)滅活48小時，每2小時搖勻一次，備檢。

本文檔共24頁；當前第22頁；編輯于星期一\23點49分方

法：

100g+400ml滅菌生理鹽水——高速組織、搗碎碎機勻