用ImageProPlus分析免疫組化圖片

用Image-ProPlus(IPP)

分析免疫組化圖片本文檔共61頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分1.免疫組化圖片分析原理根據(jù)染色染料顏色的深淺及分布面積大小來確定目標(biāo)蛋白的量。染色區(qū)域分布面積與目標(biāo)蛋白量成正比。染色的顏色深淺與目標(biāo)蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律，是對數(shù)關(guān)系。本文檔共61頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分1.1光密度與灰度—迷惑人的不同概念光密度：吸收光的物質(zhì)的光學(xué)密度。（opticaldensity,就是常說的OD值）光密度值是直接與染色物質(zhì)的量相關(guān)的?；叶龋夯沂遣粔蚝?，是反射亮度的單位。電子照片上像素的亮度稱為灰度。本文檔共61頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分Gray:betweenwhiteandblackExample:1.Thebrightvalueondisplayscreenisgrayvalue.2.Thedarkvalueonawhitepaperisalsothegrayvalue.255本文檔共61頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分OpticalDensity:

吸光物質(zhì)的光學(xué)密度.被測物質(zhì)的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值與物質(zhì)的量直接相關(guān)，數(shù)字圖象上點(diǎn)的灰度值與對應(yīng)物質(zhì)OD值成對數(shù)關(guān)系，符合朗伯-比爾定律。理論上OD值是從零到無窮大。實(shí)際應(yīng)用中，OD值的范圍常用

0-2.0或者0-3.0。本文檔共61頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分用OD值是正確的分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀的測定值是OD值透射的顯微鏡圖象上的光強(qiáng)度要用OD值蛋白電泳條帶的測量也是OD值。螢光顯微鏡及螢光分光光度計(jì)的測量值是螢光強(qiáng)度(Fluorescenceintensity)用EB染色的DNA凝膠電泳條帶也是螢光強(qiáng)度，但處理方法與光密度相同，故也用OD值。這個(gè)OD與前面的OD又有不同的意義。它就是熒光的光密度。反映著熒光物質(zhì)的多少。本文檔共61頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分處理照片時(shí)用的卻是灰度各種圖象被拍攝成照片進(jìn)行數(shù)字圖象處理時(shí)，計(jì)算機(jī)是對照片的灰度進(jìn)行測量和計(jì)算的。為了定量物質(zhì)含量，最后還是需要轉(zhuǎn)換為OD值來表示。所以對免疫組化照片的分析結(jié)果應(yīng)該是一個(gè)OD值，光密度。不應(yīng)該是灰度。準(zhǔn)確地說，是對免疫組化照片的特定染色區(qū)域的灰度進(jìn)行分析從而測量出組織切片的光密度值。本文檔共61頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分用標(biāo)準(zhǔn)樣品才能把OD值

與樣品量關(guān)聯(lián)到一起OD值是一個(gè)沒有單位的相對值。使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)時(shí)要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對電泳條帶進(jìn)行定量分析時(shí)一樣要作標(biāo)準(zhǔn)曲線。電泳條帶照片的灰度值與樣品量的關(guān)系為指數(shù)函數(shù)。在把灰度值轉(zhuǎn)換成OD值時(shí)，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)行定量分析是不準(zhǔn)確的。多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線亦有很大誤差，因此只能說是半定量分析。本文檔共61頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分1.2定量分析的指標(biāo)：

IOD(Integratedoptiondensity)

與MeanDensity將圖片上各點(diǎn)的光密度值累加起來，得到IOD。此值與目標(biāo)物質(zhì)的總量成正比。IOD值除以有效目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到Meandensity，此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。對樣品照片進(jìn)行數(shù)字圖像分析比較時(shí)，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。本文檔共61頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分1.3比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色深度一樣，染色面積大的質(zhì)量大照片A照片B本文檔共61頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分比較兩張照片的染色物質(zhì)量的差別兩張照片染色區(qū)域面積相同，染色深的質(zhì)量大照片A照片B本文檔共61頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分這回該怎么看？A的顏色深，面積小。B的顏色淺，面積大。照片A照片B本文檔共61頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分比較體積！

尺寸光密度本文檔共61頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分1.4實(shí)際圖片的情況很復(fù)雜的。陽性樣品染色深，陰性樣品染色淺。本文檔共61頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分直接比較整張圖片的IOD

等于在比較整張圖片的meandensity本文檔共61頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分哪一個(gè)染色物更多？染色區(qū)域顏色深度接近，染色面積有差異。本文檔共61頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分使用不同的area會得到不同的結(jié)論

要結(jié)合切片情況來判斷。IOD對整張圖片的面積作平均。IOD對特定組織區(qū)域的面積作平均。IOD對顯色的組織區(qū)域作平均。本文檔共61頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分對整張圖片區(qū)域進(jìn)行平均的情況比較少，這張圖片中黃色的IOD值主要來自于中間一塊區(qū)域內(nèi)。本文檔共61頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分右上角的空白區(qū)面積應(yīng)該扣除。本文檔共61頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分也許應(yīng)是這個(gè)特定的組織區(qū)域本文檔共61頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分這個(gè)區(qū)域是特定染色的區(qū)域。在計(jì)算IOD時(shí)能同時(shí)計(jì)算出來，但以此為平均面積往往并不正確。本文檔共61頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分對單個(gè)細(xì)胞的分析比較單個(gè)細(xì)胞的IOD單個(gè)細(xì)胞的meandensity照片上各細(xì)胞IOD或meandensity的平均值本文檔共61頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分邊界不清晰的貼壁細(xì)胞整張圖片IOD/細(xì)胞個(gè)數(shù)（照片中細(xì)胞數(shù)目不多，數(shù)起來不費(fèi)事）本文檔共61頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分細(xì)胞簇的分析測量整張圖片黃色區(qū)域IOD。再測量細(xì)胞分布的區(qū)域面積area。對染成藍(lán)色的細(xì)胞核計(jì)數(shù)，作為細(xì)胞數(shù)N。以IOD/（N）作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。或IOD/area本文檔共61頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分2.從圖片上分析光密度方法

的技術(shù)進(jìn)步簡單測量整張照片的光密度值。在照片上隨機(jī)選取數(shù)個(gè)區(qū)域，測量其光密度值。計(jì)算其平均值作為整張照片的光密度值。在照片上準(zhǔn)確選擇被染上染料的特定顏色的區(qū)域，計(jì)算這些區(qū)域的累積光密度值（IOD），進(jìn)而計(jì)算統(tǒng)計(jì)區(qū)域的平均光密度值。本文檔共61頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分2.1測定整張照片的光密度-圖象分析儀其測定原理有點(diǎn)象分光光度計(jì)，直接測定切片的整體光密度?？梢愿鶕?jù)照片上象素點(diǎn)的亮度來區(qū)分測定區(qū)域其缺陷是顯而易見的。復(fù)染上的其他顏色的染料也會產(chǎn)生光密度吸收，導(dǎo)致嚴(yán)重的干擾。本文檔共61頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分2.2抽樣測量光密度在彩色電子圖片上選取目標(biāo)顏色區(qū)域，抽樣測量這些小區(qū)域的灰度值，取其平均值作為比較染色深淺的指標(biāo)。隨機(jī)選取幾個(gè)區(qū)域

但是能作到“隨機(jī)”嗎？本文檔共61頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分2.3ImageProplus的獨(dú)特優(yōu)勢。準(zhǔn)確地按照一個(gè)顏色標(biāo)準(zhǔn)來選取一個(gè)AOI(areaofinteresting)。測量這個(gè)區(qū)域的光密度參數(shù)。本文檔共61頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分使用IPP比前兩種方法更好。在查到文獻(xiàn)中使用的圖象分析方法是前兩種的時(shí)候，完全可以用IPP的分析測量來代替。結(jié)果更加準(zhǔn)確。不必照搬文獻(xiàn)上所述的方法。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，以后也許還會有更好的圖象分析方法及圖象分析程序的。本文檔共61頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.用IPP分析免疫組化圖片的過程拍攝樣品照片。選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域（AOI，areaofinteresting）。測量該區(qū)域的IOD。選擇并測量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積計(jì)算光密度平均值IOD/area（meandensity）計(jì)算同一實(shí)驗(yàn)組切片各照片的平均及標(biāo)準(zhǔn)差。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各實(shí)驗(yàn)組的平均meandensity之間是否有顯著性差異。本文檔共61頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.1用于免疫組化半定量分析的照片拍攝與普通顯微鏡照片不同，用于免疫組化分析的顯微鏡照片有其特殊的拍攝要求。本文檔共61頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分顯微鏡光源正確調(diào)整顯微鏡光源為日光色溫的白色光。此時(shí)是加藍(lán)色濾光片，燈絲電壓為9V左右。一般的顯微鏡上都會有指示的。此時(shí)的鏡下視野會感覺明亮得有點(diǎn)刺眼。不能通過調(diào)整聚光鏡光圈的方法減低亮度，這會影響到光學(xué)系統(tǒng)分辨率及圖象的清晰度。不能加過大的灰度鏡減低亮度。用25%的ND濾光片還行。6%的ND濾光片常導(dǎo)致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，將直接影響到照片色彩，從而使得測量結(jié)果不準(zhǔn)確。本文檔共61頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分固定顯微鏡的工作條件不僅是光源亮度，除了更換樣品時(shí)調(diào)節(jié)載物臺位置，其他部件一律固定下來。特別是不要來回切換使用不同放大倍數(shù)的物鏡。使用一個(gè)物鏡拍攝所有的照片后，再切換到另一個(gè)物鏡上拍攝照片。為保證顯微鏡光源的穩(wěn)定一致，所有照片應(yīng)該一次拍攝完成。不能分?jǐn)?shù)次拍攝。若能給顯微鏡加上穩(wěn)壓電源就更好了。這能保證顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定。本文檔共61頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分必須使用手動(dòng)控制曝光的相機(jī)對每張照片要使用相同曝光時(shí)間，而不是由相機(jī)自動(dòng)控制曝光。染色深的陽性樣品就應(yīng)該拍攝得較暗。染色淺的陰性對照樣品則應(yīng)該拍攝得較明亮。各種拍攝條件確定后，就必須使用這個(gè)條件一次拍攝完所有的照片。以保證它們的曝光一致。本文檔共61頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分控制相機(jī)曝光時(shí)間要把相機(jī)曝光時(shí)間控制到使視野中空白的地方呈現(xiàn)純亮的白色。拍攝出的照片上，沒有組織的空白處的背景灰度值應(yīng)達(dá)到230左右?？梢允褂脠D象分析軟件測量一下空白處的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易產(chǎn)生色彩的偏離，會影響到圖像分析數(shù)值的偏差。同時(shí)背景灰度值也不宜過高。把空白灰度值調(diào)到230以上相當(dāng)于在分光光度計(jì)上調(diào)節(jié)100%透射。本文檔共61頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分背景的影響左圖：暗且偏藍(lán)的背景嚴(yán)重影響到了陽性區(qū)域的色調(diào)。而且降低了黃色象素點(diǎn)的IOD值。這會嚴(yán)重影響分析結(jié)果。有的CCD具有手動(dòng)較正色溫的功能，可以較正一下背景色調(diào)，但暗背景既使不偏色也是影響分析結(jié)果的。本文檔共61頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分較暗的背景值對分析結(jié)果的影響顯著性差異無顯著性差異本文檔共61頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分扣背景后依然沒有顯著性差異注意誤差線增大了，依然沒有顯著性差異本文檔共61頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分不能使用相機(jī)的自動(dòng)白平衡自動(dòng)白平衡功能是相機(jī)根據(jù)照片總體色彩情況自動(dòng)對每張照片進(jìn)行白平衡校正。這會嚴(yán)重影響分析測量的準(zhǔn)確性。顯微鏡照片用一兩種染料染色，照片的色彩就應(yīng)該是不平衡的，不能校正。本文檔共61頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分最好使用專業(yè)CCD拍攝民用數(shù)碼相機(jī)適用于拍攝日常生活中的照片，其自動(dòng)曝光、自動(dòng)白平衡功能會有效改善照片的直觀效果。但對于顯微鏡照片，這些功能卻會改變照片的原始面貌，而且它對每一張照片都使用了不同的拍攝條件。嚴(yán)重影響照片的分析測量結(jié)果。要想關(guān)閉這些功能，往往要進(jìn)行很復(fù)雜的設(shè)置。不能使用自動(dòng)白平衡校正，但在拍攝前使用手動(dòng)的白平衡校正背景色彩卻是必須的。在拍攝照片時(shí)要對相機(jī)進(jìn)行背景色彩校正，使得拍攝出的照片中空白的背景呈白色。這種較正將應(yīng)用于所有拍攝的照片上，與自動(dòng)白平衡較正不同。自動(dòng)白平衡較正是對每一張照片都進(jìn)行各自不同的色彩較正。本文檔共61頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分應(yīng)當(dāng)把照片存為無損壓縮格式TIFF特別是對于染色較淺的圖片，保存為jpeg格式后會損失亮度細(xì)節(jié)，導(dǎo)致測量誤差增大。注意那些馬賽克本文檔共61頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分總結(jié)拍攝注意事項(xiàng)：調(diào)整顯微鏡光源亮度（電壓9伏），足夠白，足夠亮。調(diào)整相機(jī)曝光時(shí)間，使背景呈現(xiàn)白色?；叶戎底詈媚苓_(dá)到230以上。確認(rèn)相機(jī)未使用自動(dòng)白平衡功能。但要使用手動(dòng)校正白平衡功能校正背景色彩為純白色。使用同樣的顯微鏡工作條件與相機(jī)工作條件（曝光及白平衡設(shè)置）一次拍攝完所有照片。保存照片為TIFF格式。相素不必太大。本文檔共61頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2用Image-proplus分析免疫組化圖片與photoshop不同，image-proplus是一個(gè)圖片分析和定量測量軟件。IPP的功能不是用來美化圖片，如果照片效果不好或分析結(jié)果不理想，要從切片處理與拍攝過程上找原因，而不應(yīng)試圖通過對圖片的修飾與處理來解決問題。通過IPP的分析測量只應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確地反映圖片本身的真實(shí)測量數(shù)據(jù)。本文檔共61頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2.1開始使用IPPIPP的程序界面是典型的windows風(fēng)格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。進(jìn)入IPP后的第一件事就是打開一幅待分析的圖片。本文檔共61頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分本文檔共61頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分將分析圖片信息保存到數(shù)據(jù)庫中在程序中保存分析圖片過程信息是保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的基本原則，必須遵守。將圖片信息及圖片分析過程及分析的信息存入IPP程序數(shù)據(jù)庫是一種保存實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的操作。要注意對同一張圖片進(jìn)行同樣的操作，由于一些手動(dòng)的操作無法準(zhǔn)確地重復(fù)，所以會出現(xiàn)兩次同樣的測量得到有差異的結(jié)果的情況。這也是保存測量結(jié)果的理由之一。本文檔共61頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2.2進(jìn)行光密度值較正。本文檔共61頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分光密度值校正前面曾經(jīng)說過，電子照片上象素點(diǎn)的強(qiáng)度是以灰度值來定義的，對8bit的數(shù)字圖象，最亮的白色其灰度值為255。最暗的黑色其灰度值為0。這正好與免疫組化染色的光密度值（OD）相反，所以必須進(jìn)行校正。定義灰度值大的白色為光密度值=0；定義灰度值最小的黑色光密度值為無窮大。為方便計(jì)算，常常把純黑點(diǎn)的光密度值定為2.0或3.0。光密度值與灰度值的轉(zhuǎn)換關(guān)系符合朗伯-比爾定律，因此是對數(shù)關(guān)系。光密度較正的另一個(gè)作用是扣除背景。照片的白色背景處的灰度值（光密度值）往往小于255，定義這個(gè)小于255的值為光密度零點(diǎn)實(shí)際上就是在扣背景。本文檔共61頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分正規(guī)的光密度值較正理論上，應(yīng)該制作已知量的標(biāo)準(zhǔn)樣品（空白樣、標(biāo)準(zhǔn)樣系列、全黑樣品）來進(jìn)行光密度值較正。能得到更精確的分析結(jié)果。在實(shí)際操作中，標(biāo)準(zhǔn)樣的制作十分麻煩，而且難于精確制作。實(shí)用性并不大。由于切片染色過程的影響因素太多，很難精確控制。所以最后的分析測量結(jié)果依然屬于半定量分析。本文檔共61頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2.3選擇測量參數(shù)及分析指標(biāo)在分析免疫組化圖象時(shí),一般是測量選定的具有特定顏色的區(qū)域的面積與累積光密度(IOD)對免疫組化的顯微照片,一般應(yīng)分析它的平均光密度.即時(shí)IOD/area.根據(jù)圖象的特點(diǎn),要分別測量選擇區(qū)域的IOD及area.對不同的組織照片，要使用不同的測量指標(biāo)來進(jìn)行比較。IPP可以測量多種幾何尺寸及光密度指標(biāo)，可以根據(jù)需要選擇。在這個(gè)過程中，還可以設(shè)置數(shù)據(jù)過濾限制來去除干擾性的無效測量數(shù)據(jù)。本文檔共61頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分本文檔共61頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2.4選取特定的待測對象(Objects)一般免疫組化樣品中黃色的區(qū)域?yàn)殛栃匀旧珔^(qū)域。在測量時(shí)應(yīng)當(dāng)測量這些黃色（棕黃色）區(qū)域的光密度值。不測量其他顏色部分的。因此首要的任務(wù)就是把這些黃色的區(qū)域挑選出來。IPP可以根據(jù)圖片上象素點(diǎn)的顏色來自動(dòng)選取待測區(qū)域的。使用segmentation工具。對于色差小的圖象，還可以使用手動(dòng)的AOI工具定義待測區(qū)域。本文檔共61頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分用IPP選取特定顏色區(qū)域選擇特定顏色的區(qū)域是IPP最有特色的功能，按照特定的顏色特征選取圖象中的特定區(qū)域，并計(jì)算這些區(qū)域的面積等幾何尺寸與光密度數(shù)據(jù)，就是IPP分析圖像工作的中心任務(wù)。Segmentation：適用于選取整張圖片中具有特定顏色的所有區(qū)域。IrregularAOI:手動(dòng)選擇待測區(qū)域的工具。本文檔共61頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分IrregularAOI工具是手動(dòng)工具。

A:trace方式,手動(dòng)或自動(dòng)尋找區(qū)域邊界本文檔共61頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分B：Magicwand方式,定義一片特定灰度范圍的區(qū)域。本文檔共61頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分Segmentation工具：完全按照顏色標(biāo)準(zhǔn)來選取多個(gè)相同顏色的區(qū)域本文檔共61頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分3.2.5測量并導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)本文檔共61頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期一\17點(diǎn)49分測量指標(biāo)：1.整張圖片所有對象的IOD累加值（IODSUM）2