第三章基因工程常用技術(shù)

第三章基因工程常用技術(shù)一、質(zhì)粒DNA的提取二、核酸凝膠電泳技術(shù)三、核酸分子雜交技術(shù)四、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)五、DNA序列分析技術(shù)1本文檔共121頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分質(zhì)粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技術(shù)，最常用的是堿裂解法。一、質(zhì)粒DNA的提取2本文檔共121頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分在強(qiáng)堿性溶液中，DNA雙鏈的氫鍵斷裂變性；當(dāng)溶液恢復(fù)中性時(shí)，DNA雙鏈復(fù)性。（一）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1、原理3本文檔共121頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分在變性后雙鏈不分離、復(fù)性快。共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA：4本文檔共121頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分強(qiáng)堿性變性后雙鏈分離、難以復(fù)性而形成纏繞結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，離心時(shí)沉淀。線性染色體DNA：5本文檔共121頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2、堿裂解法質(zhì)粒DNA提取的步驟1）溶菌使用“溶液I”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。溶液I：50mM葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/ml溶菌酶6本文檔共121頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分葡萄糖：增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力的作用而降解（震蕩）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯合劑，抑制DNase活性，防止DNA被降解。7本文檔共121頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分溶菌酶：為糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分--肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，具有溶菌作用。8本文檔共121頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2）變性加入“溶液II”，使細(xì)菌細(xì)胞膜破壞、使蛋白質(zhì)和DNA變性。溶液II：0.2NNaOH（10N貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）1%SDS9本文檔共121頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分NaOH：是強(qiáng)堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。是離子型表面活性劑，溶解細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白質(zhì)-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNase）變性沉淀。SDS：10本文檔共121頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分3）中和加入“溶液III”使DNA復(fù)性、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。溶液III：

5NKAc60ml冰HAc11.5ml水8.5ml11本文檔共121頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分KAc：用冰HAc把KAc溶液的pH調(diào)到4.8，以中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度KAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉淀。冰HAc

：12本文檔共121頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分上清液中含有質(zhì)粒DNA。4）離心去除沉淀13本文檔共121頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分5）純化DNA酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提或柱層析。14本文檔共121頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分酚：比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚。

蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。防止抽提時(shí)振蕩起泡。氯仿：異戊醇：15本文檔共121頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分

2倍體積的無水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNADNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。16本文檔共121頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分70%乙醇洗滌DNA，干燥。7）洗滌8）貯存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，貯存于-20℃。17本文檔共121頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分TE：由Tris-HCl緩沖液和EDTA配制。

EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。

Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸或硼酸緩沖液），利于后續(xù)操作。

RNaseA：降解殘留的RNA。18本文檔共121頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分許多公司研制出商品化質(zhì)粒提取試劑盒，原理大多依照堿裂解法，但在純化步驟上采用柱層析。19本文檔共121頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分3、影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素質(zhì)粒的產(chǎn)量受提取過程中各因素的影響，但最重要的是菌株的遺傳背景和質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。20本文檔共121頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分一般使用endA基因突變的E.coli菌株，如DH5、JM109等。1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶I，在Mg2+存在下，可將雙鏈DNA消化為7bp的寡核苷酸片斷。21本文檔共121頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。2）質(zhì)?？截悢?shù)3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)?？截悢?shù)低。22本文檔共121頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量pUCpGEMpBR322ColE1pSC1012.7kb2.7kb4.4kb4.5kb9.0kb500-700300-700>25>15≈62.9-4.11.8-4.1>0.32>0.15≈0.12質(zhì)粒分子大小拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量（kb）（g/ml）23本文檔共121頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（二）DNA的定量和純度測定1、紫外光譜法原理：基于DNA在260nm波長處有特異的紫外吸收峰（蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度計(jì)直接測定。24本文檔共121頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml。25本文檔共121頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分純DNA樣品：OD260/OD280=1.8OD260/OD230>2.0OD260/OD230<2.0：有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD280<1.6：有蛋白質(zhì)污染；OD260/OD280>1.9：有RNA污染；26本文檔共121頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分原理：利用溴化乙錠(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能發(fā)紅色熒光，將其熒光強(qiáng)度與已知濃度的DNA(如DNAmarker)電泳條帶對比，可估算出DNA含量。2、瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)27本文檔共121頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（三）DNA分子量的估計(jì)通過瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNAmarker對比得知。28本文檔共121頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分二、核酸凝膠電泳技術(shù)（一）電泳的基本原理

生物大分子在一定pH條件下，通常帶電荷，將其置于電場中，會以一定的速度向與其電荷性質(zhì)相反的電極遷移，遷移速度稱電泳速率。29本文檔共121頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分摩擦系數(shù)與分子的大小、構(gòu)型及介質(zhì)的粘度有關(guān)。

電泳速率與電場強(qiáng)度、分子所帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。30本文檔共121頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分在生理?xiàng)l件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，故DNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)，在電場中向方向遷移。糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上重復(fù)，故等量的雙鏈DNA幾乎帶等量的凈電荷。正極31本文檔共121頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分如電場強(qiáng)度一定、電泳介質(zhì)相同，電泳速率就取決于核酸分子的大小和構(gòu)型。構(gòu)型相似的分子：分子量越大、遷移越慢。分子量相同的分子(如質(zhì)粒)：cccDNA遷移最快、L-DNA次之、ocDNA最慢。32本文檔共121頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分33本文檔共121頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分34本文檔共121頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分固體支持介質(zhì)：瓊脂糖(agarose)聚丙烯酰胺(polyarylamide)固體支持介質(zhì)可形成復(fù)雜的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，DNA穿過這些網(wǎng)孔才能到達(dá)正極。分子量小、結(jié)構(gòu)致密的DNA分子更易穿過網(wǎng)孔，泳動速度也越快。35本文檔共121頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（二）瓊脂糖凝膠電泳

是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。瓊脂糖：36本文檔共121頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分瓊脂糖凝膠：瓊脂糖在電泳液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后凝固成均勻的膠體“胨”，成為很好的電泳介質(zhì)。37本文檔共121頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分瓊脂糖濃度(%)分離DNA的范圍(kb)0.3

5-600.6

1-200.7

0.8-10

0.9

0.5-71.2

0.4-61.5

0.2-42.0

0.1-3瓊脂糖濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。38本文檔共121頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺和N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成。

39本文檔共121頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分在過硫酸銨和TEMED存在時(shí)，丙烯酰胺單體形成長鏈，由N,N’-甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交聯(lián)，形成聚丙烯酰胺。40本文檔共121頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分為中樞神經(jīng)毒物，盡量避免接觸和吸入!過硫酸銨：催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，加速聚合。丙烯酰胺和N,N’-甲叉雙丙烯酰胺：堿性條件下產(chǎn)生自由基。TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二銨)：41本文檔共121頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分聚丙烯酰胺濃度(%)分離DNA的范圍(bp)3.51000-20005.085-500

8.060-40012.040-200

15.025-150

20.06-100聚丙烯酰胺濃度的高低決定凝膠孔隙的大小，濃度越高、孔隙越小、分辨率越高。42本文檔共121頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分聚丙烯酰胺凝膠的優(yōu)點(diǎn)：比瓊脂糖凝膠的分辨率高得多。0.3-2%瓊脂糖凝膠電泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率：2,000-6bp。43本文檔共121頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（四）電泳緩沖液Tris-乙酸（TAE）

Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）TAE價(jià)格便宜，但緩沖容量低；TBE與TPE緩沖容量高，分離效果好，但TPE在DNA片段回收時(shí)含磷酸鹽濃度高，易使DNA沉淀。推薦使用44本文檔共121頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分EDTA可螯合二價(jià)陽離子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。臨用時(shí)用水稀至0.5TBE（20倍稀釋）10TBE緩沖液的配制：

Tris堿108g

硼酸Boricacid55g

EDTA9.3g

加H2O至1L（調(diào)PH為8.0-8.2）45本文檔共121頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（五）核酸電泳的指示劑與染色劑1、指示劑：

常用溴酚蘭，在堿性液體中呈紫蘭色，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，遷移率分別與1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。46本文檔共121頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分使樣品呈色，便于加樣操作；指示劑與蔗糖、甘油組成加樣緩沖液。增加樣品比重，確保DNA均勻沉入加樣孔；在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測DNA電泳的速度和位置。加樣緩沖液的作用：47本文檔共121頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分48本文檔共121頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2、染色劑：核酸電泳后，需經(jīng)染色才能顯出帶型。溴化乙錠染色法銀染色法49本文檔共121頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)能插入到DNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出紅色熒光。1）溴化乙錠染色法：50本文檔共121頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分可將EB直接加到凝膠介質(zhì)中（終濃度0.5g/ml）；也可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色10-15min。EB與DNA分子結(jié)合，而不與凝膠結(jié)合，DNA分子吸收EB并發(fā)出熒光。51本文檔共121頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分瓊脂糖凝膠EB染色后，在紫外光下觀察，可檢測出≥50ng的DNA。在適當(dāng)染色條件下，熒光強(qiáng)度與DNA片段的數(shù)量成正比。52本文檔共121頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2、銀染色法：Ag+可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，用還原劑(如甲醛)使Ag+還原成銀顆粒，可將電泳條帶染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝膠染色。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度比EB高200倍。缺點(diǎn)：銀染色后，DNA不宜回收。53本文檔共121頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染結(jié)果銀染10min銀染15min54本文檔共121頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分三、核酸分子雜交技術(shù)1968年，華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的RoyBritten及其同事發(fā)明。目的：用特異探針鑒定復(fù)雜靶DNA中的同源片段。55本文檔共121頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分DNA與DNA雜交：A=T、G≡C

DNA與RNA雜交：A=U、G≡C依據(jù)：堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性隨溫度逐漸降低，變性的兩條單鏈重新形成互補(bǔ)雙鏈。在高溫下，核酸雙鏈解為兩條單鏈；堿基互補(bǔ)變性：復(fù)性：56本文檔共121頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針(probe)，與待測樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對，以判斷有無互補(bǔ)同源核酸序列的存在。57本文檔共121頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（一）核酸探針指一段帶有檢測標(biāo)記、與目的DNA片段特異互補(bǔ)、已知序列的核酸片段。探針長度一般以50-300bp為宜。58本文檔共121頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分核酸探針的種類：放射性探針非放射性探針根據(jù)核酸性質(zhì)不同，分為：RNA探針寡核苷酸探針DNA探針cDNA探針根據(jù)標(biāo)記方法不同，分為：59本文檔共121頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分寡核苷酸探針(oligonucleotideprobe)簡并探針組成的寡核苷酸探針庫6個氨基酸連續(xù)序列→倒推基因序列→人工合成單一已知序列的寡核苷酸探針已知序列→人工合成60本文檔共121頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分根據(jù)生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針；簡并探針的設(shè)計(jì)依據(jù)：參考生物體EST(expressedsequencetag)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行傾向性簡并序列設(shè)計(jì)。EST：對一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆，進(jìn)行5’端和3’端單一次測序，獲得的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分，平均長度360±120bp。61本文檔共121頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分寡核酸探針的優(yōu)點(diǎn)：序列短，雜交速度快、特異性強(qiáng)；可在短時(shí)間內(nèi)大量制備；可在合成中進(jìn)行標(biāo)記；可合成單鏈探針，避免雙鏈探針在雜交中自我復(fù)性，提高雜交效率；可檢測靶序列內(nèi)1個堿基的變化。62本文檔共121頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則：長度18-50bp；分子內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū)；GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGCAG+C含量40-60%；避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)（不能多于4個）；與非靶序列70%以上同源性、或連續(xù)8個以上堿基序列相同，最好不用。63本文檔共121頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分1、標(biāo)記物的種類：前者更敏感，但后者保存時(shí)間較長，無同位素污染。非放射性：生物素、地高辛、熒光素等。放射性：32P、35S、125I等；（二）核酸探針的標(biāo)記64本文檔共121頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分缺刻平移法隨機(jī)引物延伸法反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法末端標(biāo)記法2、探針標(biāo)記方法：1）放射性同位素標(biāo)記：65本文檔共121頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分5’…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’1）Klenow酶介導(dǎo)的3’末端標(biāo)記法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5’…G-C-T-G-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G…3’3’…C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C…5’末端標(biāo)記法66本文檔共121頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分5’3’3’5’AA-32P-ddATPTdT5’5’2）TdT介導(dǎo)的3’末端標(biāo)記法：

67本文檔共121頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分3）T4-PNP介導(dǎo)的5’末端標(biāo)記法：5’P3’HOOH3’P5’

5’HO3’HOOH3’OH5’

CIPT4-PNP-32P-ATP5’P3’HOOH3’P5’68本文檔共121頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2）非放射性同位素標(biāo)記：

酶促反應(yīng)標(biāo)記法化學(xué)修飾標(biāo)記法69本文檔共121頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，再利用酶促反應(yīng)，將標(biāo)記的核苷酸摻入探針中。酶促反應(yīng)標(biāo)記法1）標(biāo)記物-dUTP的生成；（如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）2）將標(biāo)記物-dUTP作為DNApolI的底物，摻入DNA分子中。70本文檔共121頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分Bio-11-dUTP：生物素(Biotin)Biotin與dUTP之間連接臂的碳鏈長度。11：Bio：廣泛存在于各種組織中，若樣品本身含內(nèi)源性生物素，會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。71本文檔共121頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分Dig-11-dUTP：地高辛(digoxigenin)；Dig：洋地黃植物的花和葉是Dig在自然界中的唯一來源，抗Dig抗體不會與其他生物物質(zhì)結(jié)合，可滿足特異性標(biāo)記的需要。從洋地黃植物中提取的類固醇物質(zhì)。72本文檔共121頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分地高辛系統(tǒng)標(biāo)記：DIG-11-dUTPDIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物73本文檔共121頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分化學(xué)修飾標(biāo)記法利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上。74本文檔共121頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分ABC熒光標(biāo)記：熒光胺Avidin鏈親和素GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烴連接臂ABC：AvidinBiotinComplex75本文檔共121頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分ABC顯色酶標(biāo)記：GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烴連接臂顯色酶生色底物顏色產(chǎn)物Avidin鏈親和素ABC：AvidinBiotinComplex76本文檔共121頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分（三）核酸分子雜交的分類待測核酸樣本先結(jié)合到固相支持物（硝硝酸纖維素膜、尼龍膜等）上，再與溶液中的特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。待測核酸樣本與特異性探針同時(shí)溶于雜交液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。液相雜交：固相雜交：77本文檔共121頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分液相核酸分子雜交78本文檔共121頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分固相核酸分子雜交制備待測核酸樣品制備核酸探針分離、變性、轉(zhuǎn)印、固定與雜交液預(yù)雜交標(biāo)記漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針檢測雜交信號雜交加入標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交：消除膜對探針的非特異性結(jié)合，降低雜交背景。79本文檔共121頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交菌落雜交夾心雜交原位雜交常用固相核酸雜交方法80本文檔共121頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分1、Southern印跡雜交是將DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。1975年，由英國愛丁堡大學(xué)的EdwenSouthern創(chuàng)建，故稱Southernblot。81本文檔共121頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分提取DNA樣本→限制酶酶切→瓊脂糖凝膠電泳分離→NaOH變性→DNA轉(zhuǎn)印至膜上→預(yù)雜交→標(biāo)記探針與之雜交→放射自顯影或顯色反應(yīng)→檢測雜交信號→結(jié)果分析。Southernblot的基本過程：用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。82本文檔共121頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分83本文檔共121頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分水稻葉綠體DNA分別用BglII(A-C)、BamHI(D-F)、EcoRI(G-I)、HindIII(J-L)消化，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后與32P標(biāo)記的玉米psbA探針Southern雜交，X光底片中顯現(xiàn)陽性條帶，表明含玉米psbA基因序列。84本文檔共121頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分2、Northern印跡雜交1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。方法與Southernblot類似，故稱Northern印跡雜交（Northernblot）。85本文檔共121頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉(zhuǎn)印至膜上→預(yù)雜交→標(biāo)記探針與之雜交→放射自顯影或顯色反應(yīng)→檢測雜交信號→結(jié)果分析。Northernblotting的基本過程：用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。86本文檔共121頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分87本文檔共121頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分3、斑點(diǎn)雜交/狹縫雜交（spot/slotblothybridization）基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點(diǎn)到膜上，或通過一個長形狹縫轉(zhuǎn)印至膜上→膜變性→預(yù)雜交→標(biāo)記探針與之雜交→放射自顯影或顯色反應(yīng)→檢測雜交信號→結(jié)果分析。88本文檔共121頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分DNA樣品使用特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，可使眾多待測樣品一次同步轉(zhuǎn)印至雜交膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。點(diǎn)樣Probe-32P檢測AB123489本文檔共121頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分簡便、快速、靈敏、樣本用量少。特異性不高，有一定比例的假陽性。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：90本文檔共121頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分AB固相支持物固相吸附探針標(biāo)記檢測探針需兩個靠近且不重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標(biāo)記檢測探針。4、夾心雜交(sanwichhybridization)91本文檔共121頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分優(yōu)點(diǎn)：樣品不需固定，對粗制樣品即能做出可靠的檢測。特異性強(qiáng)，只有兩個探針都雜交時(shí)，才能產(chǎn)生可檢測的信號；92本文檔共121頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分注意：為避免產(chǎn)生高本底信號，兩探針必須分別克隆入兩個非同源載體內(nèi)，如一個克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。93本文檔共121頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分5、菌落雜交(colonyhybridization)基本過程：將菌落從平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上→裂解菌落、釋放DNA→將DNA烘干固定于膜上→標(biāo)記的探針與之雜交→放射自顯影→檢測雜交信號→與平板上的菌落對位。94本文檔共121頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分用于從大量菌落中篩選含特異DNA序列的目的重組子。95本文檔共121頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分6、原位雜交(insituhybridization,ISH)是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測DNA或RNA的技術(shù)，可對組織細(xì)胞原位的待測核酸分子進(jìn)行定性、定量及定位分析。96本文檔共121頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分優(yōu)點(diǎn)：

不需提取核酸，可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，更準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。FISH檢測HER-2基因在乳腺癌組織中的表達(dá)FISH檢測慢性粒細(xì)胞白血病的費(fèi)城染色體(22和9號染色體異位)97本文檔共121頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分是利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-退火-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。四、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerasechainreaction,PCR）98本文檔共121頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分1、模板:

（一）PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成

無論哪種DNA，都要有較高的純度。質(zhì)粒-DNA染色體DNA大小較小較大非常大目的基因單拷貝變性易較難難用量lng300-500ng可以是DNA或RNA。99本文檔共121頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分mRNAcDNAPCR，稱為RT-PCR。逆轉(zhuǎn)錄RNA作為模板時(shí)，需要：RT-PCR：ReverseTranscription

PCR

100本文檔共121頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分是根據(jù)模板DNA待擴(kuò)增區(qū)兩端的序列而設(shè)計(jì)的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為15-30bp，最多不超過50bp。

3、引物2、TaqDNA聚合酶101本文檔共121頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分引物設(shè)計(jì)的原則：長度適宜，一般15-30bp；G+C含量40-60％；4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布；內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；兩條引物之間不應(yīng)有多于4個堿基的互補(bǔ)；3’端不應(yīng)有任何修飾；5’端可修飾，如32P、生物素、熒光素。102本文檔共121頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分上游引物5’端：

起始密碼子ATG；注意：下游引物5’端：

終止密碼子TAA、TAG或TGA；上、下游引物5’端：

限制酶識別序列及其保護(hù)堿基。103本文檔共121頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分5’GGAATTCCCTATGACCCAG3’不同限制酶需保護(hù)堿基的數(shù)量不同，如：

EcoRI1HindIII>3BamHI2-3PstI>4保護(hù)堿基數(shù)量不合適，會影響限制酶酶切。保護(hù)堿基104本文檔共121頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分4、dNTPs

終濃度：50mol/L，4種dNTPs濃度應(yīng)相等。注意：不穩(wěn)定，保存時(shí)間長會失效.105本文檔共121頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分1）不同的酶需不同Mg2+：5、Mg2+：Taq酶：0.5-1.5mM；pfu酶：2-3mM；dNTP、引物用量約增加1倍。106本文檔共121頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分EDTA鰲合Mg2+；選擇低濃度TE(10mMTris,1mMEDTA)；如擴(kuò)增效率不理想，注意調(diào)整Mg2+濃度！2）外界影響：DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基團(tuán)均可結(jié)合Mg2+。107本文檔共121頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分模板DNA0.1-2g引物各10-100pmolTaq酶2.5U4種dNTP混合物各200mol/LMg2+1.5mmol/LddH2O標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：100L108本文檔共121頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分1、變性溫度：

（二）PCR參數(shù)94-95℃，一般30-45sec。模板DNA完全變性對RCR能否成功至關(guān)重要。可95℃加熱3-5min預(yù)變性。109本文檔共121頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期三\10點(diǎn)1分