第五章分子生物學(xué)的研究方法序列分析

目的與要求掌握DNA測序的一般原理和方法，通過學(xué)習(xí)，分析DNA策序與蛋白質(zhì)策序的區(qū)別。重點(diǎn)：

Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法難點(diǎn)：如何根據(jù)凝膠電泳直接讀出DNA序列學(xué)時：2學(xué)時學(xué)習(xí)方法：課堂講授與討論相結(jié)合本文檔共30頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.3.1Sanger雙脫氧鏈終止法■

2.3.2Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法■

2.3.3序列分析自動化■2.3.4雜交測序■2.3.5DNA策序的商業(yè)運(yùn)作及存在問題■2.3.6思考問題■本文檔共30頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當(dāng)時在某些技術(shù)能力上和研究思路上，存在著弱點(diǎn)，阻礙了從理論轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。第一，如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都沒有擺脫蛋白質(zhì)序列分析的束縛。1965，Cornall大學(xué)以S．W．Holle，為首的科學(xué)家小組，首次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，經(jīng)分離純化后，再分別測定短片段順序。返回DNA核酸序列分析歷程本文檔共30頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分1968年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（Dr．RayWu）獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計出一種嶄新的引物一延伸測序策略，并于1971年首次成功地測定了λ噬菌體兩個COS末端的完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增DNA的方法；M．Smith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎。引物—延伸測序策略本文檔共30頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.1.1Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應(yīng)特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補(bǔ)鏈；2、利用2’，3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法，或酶催引物合成法。本文檔共30頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分反應(yīng)：同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標(biāo)記）。變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結(jié)果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序?？伎寄悖悍磻?yīng)混合物中，標(biāo)記什么最方便？本文檔共30頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你本文檔共30頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分酶、原料比例在實(shí)際的DNA合成反應(yīng)中，使用失去了5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當(dāng)?shù)卣{(diào)整ddNTP和dNTP的比例，便能夠獲得良好的電泳譜帶模式。dNTP／ddNTP=1：100時，譜帶分離效果較佳，可讀出多于200個以上的核苷酸順序。降低ddNTP對dNTP濃度比，會產(chǎn)生逐漸加長的片段，再配合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出300個左右的核苷酸順序。dNTP／ddNTP與良好的電泳譜帶模式的關(guān)系如何？本文檔共30頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.1.2Sanger雙脫氧-M13體系DNA序列分析法引物合成DNA序列測定法的特點(diǎn)及缺陷分析：這樣處理后，能策得高分子量DNA嗎？為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序“拼排”起來，至少還需要用一種或數(shù)種其它內(nèi)切限制酶，對同種DNA作酶切消化，并進(jìn)行電泳純化和序列分析。實(shí)際上可行嗎？高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進(jìn)一步分析。本文檔共30頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分這些供作序列測定的DNA片段絕大多數(shù)都僅為數(shù)百個核酸。因此需要用物理方法分離大量的DNA片段。費(fèi)時費(fèi)錢，因?yàn)樯唐诽峁┑暮怂醿?nèi)切限制酶的價格是十分昂貴。為了保證能夠獲得所有的限制片段，就需要制備足多數(shù)量的DNA，而其中有許多步驟都要用不同濃度的凝膠進(jìn)行電泳再純化。在這種純化過程中，會加劇DNA的損傷和丟失。本文檔共30頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分克服缺點(diǎn)的一種途徑—DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機(jī)地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈DNA噬菌體，例如M13作為載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈?zhǔn)删wDNA中分離出來的一種限制片段。其特點(diǎn)是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點(diǎn)相連的單鏈DNA區(qū)段雜交。稱做“通用引物”。本文檔共30頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分M13載體克隆DNA片段將DNA片段克隆在M13mp載體特定位點(diǎn)上，即位于Lac區(qū)段中含有多克隆位點(diǎn)的多聚銜接物（polylinker）內(nèi)。重組體噬菌體，在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上形成白色的噬菌斑，而非重組體的噬菌體則形成藍(lán)色的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列分析。本文檔共30頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分當(dāng)然這種隨機(jī)的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復(fù)成原來結(jié)構(gòu)形式的總DNA序列。本文檔共30頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分使用M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。最初使用的引物，是克隆在PBR322質(zhì)粒載體上的一種短的限制片段。以后J．Messing等人（1981）發(fā)展出了一種更加適用的長度為15bp的合成引物，這段引物同M13的其它位點(diǎn)之間有低度的同源性，后來又合成出了改進(jìn)的同M13其它任何位點(diǎn)均無同源性的引物?，F(xiàn)在，應(yīng)用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經(jīng)成為一種最普遍采用的快速的DNA序列分析法。本文檔共30頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.1.3Sanger雙脫氧一pUC體系DNA序列分析法自引入M13載體系列，DNA序列分析又有了新的改良和發(fā)展。起初是使用Klenow片段，現(xiàn)在則可以使用反轉(zhuǎn)錄酶或T7DNA聚合酶。以往都是把待測DNA片段克隆到M13mp載體上，得到單鏈模板后，再按雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列分析。現(xiàn)在，可以將待測DNA片段克隆到質(zhì)粒載體上，直接用閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒DNA按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。這種方法特稱為利用雙鏈質(zhì)粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。由于通常使用的質(zhì)粒多是pUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。本文檔共30頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分Sanger雙脫氧一pUC體系DNA序列分析法基本步驟待測DNA與pBR322或pUC分子重組；轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在補(bǔ)加有Xgal-IPTG選擇性培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)；挑選白色菌落，制備質(zhì)粒NA。堿變性處理，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。優(yōu)點(diǎn)：無需將DNA克隆到M13載體上，更為簡單快速，現(xiàn)已被許多研究工作者采用。返回目錄本文檔共30頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.2Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法是1977年由美國哈佛大學(xué)的A．M．Maxam和W．Gilbert

發(fā)明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法雖然說對于大分子量的DNA片段的序列測定而言，化學(xué)修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發(fā)展速度也不及后者迅速，但是至今在相當(dāng)多的研究工作中仍被采用。返回目錄本文檔共30頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.2.1Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法的原理化學(xué)試劑處理末端標(biāo)記DNA片段，堿基的特異性切割產(chǎn)生的DNA片段混合物,電泳分離顯影后顯現(xiàn)譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。本文檔共30頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分出發(fā)材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射性標(biāo)記的DNA片段(雙鏈或單鏈）關(guān)鍵：4種核苷酸堿基中，有1～2種發(fā)生特異性的化學(xué)切割僅應(yīng)，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環(huán)上轉(zhuǎn)移出去以及在失去堿基的部位發(fā)生DNA鏈的斷裂三個主要的內(nèi)容。由于化學(xué)切割反應(yīng)特異性是由堿基的修飾作用決定的，顯然，隨后的切割反應(yīng)必定是定量的，而且同副反應(yīng)無關(guān)。本文檔共30頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分堿基特異的化學(xué)切割反應(yīng)——肼專用試劑有硫酸二甲脂和肼。肼又叫做聯(lián)氨（NH2·NH2），在堿性的條件下，它能夠從C4和／或C6原子位置作用于T和C兩種堿基，并用C4-C5-C6環(huán)化形成一種新的5原子環(huán)。聯(lián)氨的進(jìn)一步作用釋放出吡唑琳酮環(huán)，留下的嘧啶堿基的N1－C2－N3片段則仍然連接在糖環(huán)上。在具有六氫吡啶的條件下，通過β-消除反應(yīng)，2個磷酸分子便會從糖片段上釋放出來，從而導(dǎo)致在這個核苷酸位置上發(fā)生DNA鏈的斷裂。反應(yīng)體系中加入lmol/L濃度的鹽，肼同T的反應(yīng)速率便會逐漸下降，以確保發(fā)生C特異的化學(xué)切割反應(yīng)。根據(jù)這一特點(diǎn)區(qū)別C和C+T之間的降解產(chǎn)物。本文檔共30頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，DNA堿基環(huán)中的氮原子發(fā)生甲基化反應(yīng)（G

N7原子和A

N3原子）。中性PH，甲基化導(dǎo)致配糖鍵水解，留下失去堿基的糖片段作為糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于通過堿催化的消除反應(yīng)使圍繞在糖片段兩翼的磷酸脫落，造成DNA斷裂。由于A

N3原子的甲基化比GN7原子慢，故3-甲基A的配糖鍵比7-甲基G脆弱。所以前者的水解速率比后者快4～6倍。速率上的差別，是早期分析辨別DNA中的G和A的基本依據(jù)。最近采用六氫吡啶同DNA甲基化反應(yīng)，而這種反應(yīng)對甲基化的G是特異的。因此，DNA鏈的斷裂只在G發(fā)生。本文檔共30頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分本文檔共30頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.2.2化學(xué)修飾法測序圖解本文檔共30頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分CT+CG+AAAACAGTCCTACCGCTGAAGCAG+AT+CC試試看你作對了嗎？本文檔共30頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點(diǎn)21分2.5.2.3Maxam－Gilbert化學(xué)修飾法優(yōu)點(diǎn)不需要體外酶催合成反應(yīng)單雙鏈都可以需要末端標(biāo)記兩端采用不同的標(biāo)記，測序可從兩端進(jìn)行返回目錄本文檔