策劃生物催化的第三次浪潮樣本

資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯(lián)系改正或者刪除。策劃生物催化的第三次浪潮來源:生物谷日期:09月13日生物催化是在合成化學中應用酶和微生物,將天然催化劑用于酶尚未進化到的新目的。經(jīng)過幾次技術研究和創(chuàng)新浪潮,生物催化領域現(xiàn)被證明已經(jīng)達到了工業(yè)化水平。第一次生物催化浪潮始于一個多世紀前,科學家意識到活體細胞的某些成分能夠用于有用的化學轉化(與此不同的是,發(fā)酵過程早已經(jīng)成為常事上千年了)。比如,Rosenthaler使用從植物中提取的苯甲醛和氫氰酸合成了(R)-苯乙醇腈(維生素B17的有效成分之一),人們也已經(jīng)知道微生物體內進行著甾體的羥基化反應。更近的例子是,蛋白酶被用于洗衣液中,葡萄糖異構酶被用于將葡萄糖轉化為更甜的果糖,盤尼西林G?；D移酶被用于生產(chǎn)半合成抗生素。這些應用主要面臨的挑戰(zhàn)在于生物催化劑有限的穩(wěn)定性,但這些缺陷首先由酶的固定化得以克服,該方法還易化了酶的重復利用。第二次生物催化浪潮介于二十世紀八十至九十年代,最初的蛋白質工程技術,典型的是基于結構的,拓寬了酶的底物范圍從而能夠合成非常見的合成中間物上。這一改變使得生物催化擴展至藥物中間體和精細化學生產(chǎn)領域。這方面的例子包括:脂肪酶催化拆分手性前體用于合成地爾硫卓(一種降壓藥)的手性前體,醇腈裂解酶催化合成除草劑的中間體,羰基還原酶催化合成純化對映體醇用于生產(chǎn)降低膽固醇的沙汀類藥物,脂肪酶催化合成酯化臘,如化妝品的添加物肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯或鯨蠟醇蓖麻油酸酯,腈水合酶(提取自玫瑰紅紅球菌)催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺用于形成聚合物。除了酶的固定化,現(xiàn)有的挑戰(zhàn)還包括為非天然底物優(yōu)化生物催化劑?，F(xiàn)在這第三次生物催化浪潮始于PimStemmer和FrancesArnold在二十世紀九十年代中后期的工作。她們開創(chuàng)性地借助分子生物學的方法經(jīng)過體外版的達爾文進化快速而廣泛的改變生物催化劑?，F(xiàn)在這種方法一般被稱為定向進化,盡管該詞從1972年的全細胞實驗后一直在使用。這項技術最開始的做法包括:將蛋白質中氨基酸的隨機突變經(jīng)過重復循環(huán)累積起來,然后選擇或篩選所得到的文庫,最終得到穩(wěn)定性更高、底物更專一、手性選擇性更好的變體。我們在此討論的接下來的改進將注意力集中在了提高定向進化的效率上,它們力求創(chuàng)造出更聰明的文庫。工業(yè)規(guī)模的生物催化過程主要涉及到水解酶、少量酮還原酶、輔助因子的再生和蛋白質在有機溶劑中保持穩(wěn)定。在一些實例中,代謝通路被優(yōu)化。比如,將各種各樣的天然菌種的基因結合后在新的宿主中生產(chǎn)1,3-丙二醇(聚酯纖維單體),這使得將給料從丙三醇變?yōu)楦奖惬@得的葡萄糖成為可能。由于當前這次生物催化浪潮所取得的進展,現(xiàn)在我們已經(jīng)能夠改造酶使其獲得不同尋常的新的能力,比如接受先前為無效的底物(一種用于合成孟魯司特的KRED,或者一種用于合成西她列汀的轉氨酶)或者改變形成的產(chǎn)物的性質(適合不同萜的萜環(huán)化酶變體或氨基酸代謝生產(chǎn)作為生物燃料的乙醇)。今天,我們還需要新的酶用于將生物質能轉化為第二和第三代生物燃料、材料和化學制品。使這第三次浪潮成為可能的關鍵的發(fā)展有:高級蛋白質工程(包括定向進化),基因合成,序列分析,生物信息學工具和電腦建模以及觀念的進步(現(xiàn)在認為,酶的改進程度能夠比之前所預計的更顯著)。改造后的酶能夠在含有有機溶劑的60攝氏度的溶液中保持穩(wěn)定,能夠接受新的底物,并能夠催化新的非天然反應。這種改造可能現(xiàn)在只需耗時幾個月,因此極大地擴展了潛在的應用。在過去,是圍繞酶的缺陷來設計基于酶的流程,而現(xiàn)在,酶被人為改造以適合流程規(guī)范。大約前,《自然》和《科學》上的文章回顧了第一和第二波生物催化浪潮并給第三次浪潮可能會帶來什么以一窺?，F(xiàn)在,正是評估這第三次浪潮所產(chǎn)生的影響并猜測下一個十年可能會帶來什么的時候。盡管生物催化涉及代謝工程和合成生物學,本綜述主要集中于酶和全細胞反應。改造酶以適合生產(chǎn)流程為了使成本最小化,化學生產(chǎn)需要穩(wěn)定的,有選擇性的,以及富有成效的催化劑,而且這種催化劑要在人們希望的流程條件下運作。要為這樣一種流程改造酶,首先要定義設計目標,如增加穩(wěn)定性,選擇性,底物范圍,或典型地,是它們的組合。在,第三次浪潮之前,只有少數(shù)可用的策略來實現(xiàn)這些目標。酶的固定化能夠增加蛋白質的穩(wěn)定性,可是這只是適度地增加了穩(wěn)定性,對大多數(shù)的化學轉化而言一般是不夠的。定向進化也是可能的,但依然很慢因為它需要構建和篩選大的文庫,但文庫所包含的大多數(shù)是退化的甚至無活性的變體。有猛烈進步的實例又很少與工業(yè)相關。這種緩慢的步伐意味著進化后的蛋白只包括少數(shù)改變,而且因此酶的性質也只是略微地改變了。盡管幾百種酶促過程已經(jīng)有工業(yè)用途,大多數(shù)涉及的酶和全細胞在遺傳上只是少量地被改變了。在過去十年間,我們對蛋白質的認識和可用的定向進化的策略的數(shù)目都增長了,這使得對酶的性質作出大的改變成為可能?？偟膩碚f,酶工程將繼續(xù)成為從眾多可能的方法中選擇其一加以應用解決手頭的問題的案例研究匯總,而不是像土木工程,電機工程,軟件工程或化學工程那樣有一種定量的方法。將這些案例研究轉化為改造原則需要使用自由能將設計目標與所需的結構改變結合起來。性質上大的改變需要大的自由能的改變。例如,穩(wěn)定性上大的改變需要折疊－去折疊平衡中大的自由能的改變(即使是不可逆的蛋白質去折疊也起始于一種可逆的部分去折疊)。對蛋白質分子水平的理解提示了可被用于改進的策略。例如,負責折疊－去折疊平衡的表面殘基以及向環(huán)內添加脯氨酸殘基都將降低去折疊形式的熵。這些策略用更小更集中的蛋白質文庫代替了大的隨機變異的文庫(大多數(shù)帶有更劣質的性質),其中小文庫含有很高比例的有活性且潛在可能已改進的變體。最后,經(jīng)過估計各種各樣的相互作用力的強度(表面離子對或添加一個脯氨酸殘基對熵的貢獻),研究者能夠估計為達到目標所需作出的改變。現(xiàn)在,很少有研究者明確地使用基于自由能的測量來規(guī)劃蛋白質工程的策略,可是將案例研究轉化為工程原則則需要定量的方法。新的改進的方法學在過去的十年間,DNA技術和生物信息學的巨大進步為生物催化領域提供了關鍵性的支持。這些工具促進了從自然資源中發(fā)現(xiàn)新的酶并大大加速了對存在的生物催化劑的重新改造。改良的DNA技術下一代的DNA測序技術使大規(guī)模的平行序列分析成為可能,而且大幅度降低成本。盡管在人類基因組序列分析的花費預計在大約70,000,000美元,到其已縮水了1,000多倍,為少于10,000美元。LifeTechnologies,Illumina和OxfordNanoporeTechnologies已宣布為在幾個小時內測完整個人類基因組而設計的測序儀器在晚些時候將能夠實現(xiàn),而且將會把每個基因組的成本降至少于1,000美元。來自不同環(huán)境的有機體的全基因序列以及環(huán)境中的DNA樣品,其包括難以培養(yǎng)的生物(元基因組),創(chuàng)造了一種豐富的資源,使得能夠而且將來也繼續(xù)能夠從中尋找新的生物催化劑。使用Illumina的大規(guī)模高通量(>10,000,000基因序列)測序技術同樣易化了探索和認知蛋白質序列－功能的相互關系。低成本的DNA合成已代替分離基因組DNA作為蛋白質工程的起始點。全基因DNA合成進一步允許為宿主生物優(yōu)化密碼子并在適宜的位點引入分子構筑結構如啟動子、終止子、增強子、限制性內切位點等等。這種DNA合成使用傳統(tǒng)的磷酰胺化學法,可是優(yōu)化了的反應條件提高了耦合效率,增加了總體質量和聚合物的數(shù)量使得序列長達200-250個核苷酸。使用照相平版印刷法和噴墨打印技術的平行DNA合成技術進一步降低了成本,加快了合成的速度。DNA合成被用于為代謝通路工程合成整條染色體DNA甚至完整的基因組。全基因合成還能夠被用于生成高質量的DNA文庫,這些文庫包括從小而專的位點飽和文庫到大而全的基因集合。定做的基因甚至基因文庫已變成大宗生產(chǎn)型化學品,和今天在研究實驗室中見到的試劑和溶劑一樣。生物信息學中的新工具作為實驗進展的補充,生物信息學工具已成為現(xiàn)代蛋白質工程中不可缺少的一部分?？缭酱蟮拿讣易宓亩嘈蛄袑Ρ群屯葱蛄胁檎乙寻l(fā)現(xiàn)了有相似催化活性的基因,并引出了新的、強效的生物催化劑。相同的序列信息使得能夠重構古代的生物催化劑,它們可能擁有更廣的底物范圍和催化多功能性(見下文)。多序列對比識別出了每個位點上最常見的氨基酸(共有序列)和能產(chǎn)生穩(wěn)定功能的酶的氨基酸替代。這些數(shù)據(jù)有助于設計含有高比例的催化活性變體的小文庫。這些文庫被用于發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性增強、催化功能提高以及立體選擇性改變了的生物催化劑。與基于序列的蛋白質工程所取得的進展相應的,結構導向的方法獲益于儲存在RCSB蛋白質數(shù)據(jù)銀行()中的蛋白質結構類似物的快速增長。在過去十年間,存儲庫增加了450%有余,包含超過77,000個蛋白質結構。這既便利了理性蛋白質設計又易化了定向進化,因為相關蛋白的結構對比有助于識別顯著的相似性和差異性從而引導設計更可靠的突變文庫。兩種不同的方法顯示了小文庫的效用,這兩種方法增加了一種酯酶分辨甲基－3－溴－2－甲基丙酸(一種手性合成纖維)時的手性選擇性。使用隨機突變并從上千個變體中篩選出了200個變體,該酶的E值(酶對一種對映體較另一種對映體的選擇性)從12增加到了19。認識到要產(chǎn)生一種有用的酶(E>30)兩種對映體在自由能差異(ΔΔΔG)上的相對小的增加(0.5千卡/摩爾)是需要的這一點,突變就集中在了活性位點上。一個包含了4個位點上所有可能的單突變(76個變體)的文庫產(chǎn)生了一個E值為61的酶(ΔΔΔG＝0.96)。理解了要解決的問題的本質,酶的優(yōu)化方法就集中在了小文庫上并產(chǎn)生了更大的進步。在這種情況下,還值得一提的是連續(xù)定向進化的一種新的方法,該方法使用了噬菌體感染系統(tǒng)和大腸桿菌的突變質粒的結合。用于工業(yè)生物催化的工程化酶的實例正如Schmid等人在她們的前瞻性的綜述中所預言的那樣,在過去十年間,輔因子的連續(xù)再生和更廣范圍的酶已被報道。然而,預言的生物芯片和組合生物催化的應用還沒有成為現(xiàn)實。非代謝細胞的生物催化應用被證明比預想的更困難,人們的傾向也就轉移到了以粗制和半純化形式使用的工程化酶。盡管歷史上全細胞曾為輔因子的再生提供了一種簡單和有效的可選辦法并增強了酶的穩(wěn)定性,現(xiàn)在蛋白質工程和使用單酶被認為更經(jīng)濟和實用。分離酶的使用還有其它優(yōu)點:它們更容易被移除(添加量更少因為單位質量的活性更高),它們耐受更嚴酷的條件,它們消除了由細胞膜引起的潛在的擴散限制,而且它們更容易在全球范圍內運輸。例如,基于KRED的流程現(xiàn)已替代了全細胞還原和基于金屬配基的化學催化,后者在過去十年間曾是工業(yè)標準。一個例外是一種全細胞過程將外消旋的乙內酰脲轉化為旋光性純的非天然的α-氨基酸。同時表示海因酶、氨甲酰水解酶和消旋酶的重組的大腸桿菌被認為是一種簡單而有效的生產(chǎn)系統(tǒng),用于代替原來的反應流程,原來的反應流程是基于在連續(xù)固定床反應器上的三種固定化酶。另外,全細胞過程不需要代謝通量控制而且反應過程中沒有不受歡迎的副反應。KRED和其它的酶被廣泛地研究用于藥物手性中間體的生產(chǎn),如阿伐她汀,立普妥的活性成分,一種降脂藥物,在的時候全球銷量為11,900,000,000美元?，F(xiàn)已開發(fā)了7種酶促法用于生產(chǎn)阿伐她汀,它們不但在酶的選擇和起始材料上有區(qū)別,而且在產(chǎn)物是原材料(含一個手性中心)還是改進的中間體(含兩個手性中心)上也有區(qū)別。在所有的這些案例中,成功需要蛋白質工程將反應速率、立體選擇性、高底物濃度(高達3M,如腈水解酶流程)或高溶劑濃度(在KRED流程中乙酸丁酯含20%)下的穩(wěn)定性進行提高或促進。除了高活性的生物催化劑,低成本過程還需要廉價的原材料和簡單的分離來獲得高產(chǎn)量的純化產(chǎn)物。一種現(xiàn)今的流程使用3步生物催化來生產(chǎn)改進的中間體:首先,將KRED和葡萄糖脫氫酶結合;其次,將上述結合物與鹵醇脫鹵酶結合以>100tyr-1的速率生成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯中間體;第三,酶促還原生成改進的二醇中間體。最近的改造將轉氨酶的底物范圍擴展至含兩個巨大的取代基的酮。該酶的改造始于一種小的底物酮,在活性位點創(chuàng)造了更多的空間并使用了越來越大的酮。幾輪定向進化將活性提高了約40,000倍并產(chǎn)生了一種工程化轉氨酶胺以代替西她列汀生產(chǎn)中的過渡金屬基氫化催化劑。始于ATA-117,一種野生型酶的接近的同系化合物,對底物沒有可測得的活性,第一個變體對前西她列汀只有很低的活性(10g/l的酶對2g/L的底物只有0.2%的轉化率),最后一種變體能將200g/l的酮轉化為對映體過量值為99.95%產(chǎn)率為92%的西她列汀。生物催化過程不但減少了總廢物消除了所有的過渡金屬,而且與金屬催化過程相比總體產(chǎn)量和生產(chǎn)率增加了53%。無數(shù)的生物催化過程為藥物生產(chǎn)擴大了規(guī)模,這證實了它們和傳統(tǒng)的化學過程相比所具有的競爭性。源于優(yōu)化研究的酶的變體是將來項目起點的一個獨特的來源。經(jīng)過使用為一個過程改造過的更穩(wěn)定的酶,下一個優(yōu)化項目將會更快。例如,改造合成R3HT的KRED時創(chuàng)造了很多穩(wěn)定的酶的變體包括一些由于低的空間選擇性而不適合的變體。然而,這些不適合的變體中的一種卻是改造DCFPE的KRED的起始酶。接著,DCFPE酶中的一種又是孟魯司特KRED的起點,孟魯司特KRED中的一種又接著是度洛西汀KRED的起點。相似的,在前西她列汀轉氨酶的進化中產(chǎn)生的轉氨酶能夠生成其它的胺,也能夠為胺合成的新的工程化酶作為起點。因此始于一個已經(jīng)在一種流程中起效的非天然的穩(wěn)定的酶變體以始料未及的方式加速了催化劑和過程的發(fā)展。同時設定兩個立構中心的酶促轉化是合成復雜分子的特別有效的方式。例如,由KRED催化的酮還原反應設定了乙醇的立構中心。然而,如果酮羰基旁的第二個立構中心在溶液中快速地外消旋而且KRED對一種結構有高度的選擇性,那么還原反應就能夠在一步中設定兩個立構中心。實例包括青霉烯中間體、假麻黃堿和苯腎上腺素,以及手性胺相類似的流程。同樣,醛縮酶現(xiàn)被用于后續(xù)反應步驟來產(chǎn)生多個手性中心,例如在合成她汀類藥物中間體中。單個酶的級聯(lián)反應如由醛縮酶催化的反應已被進一步擴展成多酶級聯(lián)反應,例如在體外合成2'-脫氧肌苷或者在體內合成復雜的分子如青蒿素或紫杉醇。生物催化過程的環(huán)境優(yōu)勢在對化學生產(chǎn)的環(huán)境方面抱有憂慮的情況下,生物催化提供了一種有吸引力的選擇。美國環(huán)境保護局在每年的美國總統(tǒng)綠色化學挑戰(zhàn)獎中頒發(fā)5個獎項。提名強調了12項綠色化學原則,原則對環(huán)境因素以及可再生原料的使用、能量效能以及工人的安全性給予了考慮。運用酶技術或者全細胞的生物催化自以來共獲得了16個獎項。生物催化劑是由可再生資源合成的而且是生物可降解以及無毒的,它們高度的選擇性簡化了反應操作并提供了更高產(chǎn)量的產(chǎn)品。生物催化過程還很安全因為它們一般在環(huán)境溫度、環(huán)境壓力和中性pH下進行。因此,這就不奇怪為什么如此多的獎項都頒給了生物催化。表2中所示的獎項的廣闊范圍展現(xiàn)了生物催化劑在非制藥工業(yè)中的應用。幾項應用涉及聚合物,特別是聚酯纖維。乳酸的優(yōu)化發(fā)酵是內布拉斯加州一家聚乳酸工廠的基礎,每年有141,000噸的產(chǎn)能,而且一條新的非天然的代謝途徑使得能夠合成1,3-丙二醇用于合成SORONA聚合物。1,4-丁二醇發(fā)酵產(chǎn)生了另一種聚合物的組成部分,斯潘德克斯彈性纖維。在聚羥基脂肪酸酯的合成過程中,生物催化劑不但催化了單體的合成而且還催化了其聚合。Yang及其合作者最近工程化了這些聚羥基脂肪酸酯合酶以將乳酸聚合成聚乳酸。幾項其它的獎項包括用于生產(chǎn)生物燃料的新的代謝通路。例如,LS9有限公司將大腸桿菌改造后以生產(chǎn)生物柴油。向大腸桿菌中加入植物的硫酯酶基因將正常的脂肪酸生物合成途徑轉化為合成適合于生物柴油的幾種脂肪酸。添加酶的基因以生產(chǎn)乙醇,然后另一種酶將乙醇和脂肪酸偶聯(lián)以形成脂肪酸乙酯,該物質可被用于生產(chǎn)生物柴油。生物柴油的產(chǎn)量比商業(yè)可行的流程至少低了10倍,但進一步的改造很可能會增加產(chǎn)量。蛋白質工程中的新概念酶的性質的大的改變一般需要多個氨基酸的替代因為這對蛋白質結構產(chǎn)生更大的改變。然而,多個氨基酸同時替代給測試帶來了指數(shù)級多的變體。在一個200個氨基酸的蛋白質的任意位點進行2個替代可產(chǎn)生7,183,900種可能,進行3個替代可產(chǎn)生9,008,610,600種可能。這些變體中很多都是沒有活性的,要么所有的變體都會被創(chuàng)造出來并加以測試以發(fā)現(xiàn)改進的變體,或者對文庫僅進行部分篩選并需要在接下來的幾輪進化中逐漸改進。這個問題最簡單的解決方法是采用更有效的篩選。底物特異性的改變能夠由高通量的方法來監(jiān)測,如熒光活化細胞分揀,它能夠在短時間內篩選成千上萬的變體。Whittle和Shanklin對一個脂肪酸去飽和酶的活性位點中的6個位置同時進行了替代然后篩選其在另一種底物上的生長情況。只有改變了底物特異性的那些變體才能夠生長。Seeling和Szostak使用了很大的隨機文庫(高達1013個變體),從中她們能夠基于產(chǎn)物對柱子的結合情況篩選催化RNA連接的變體,而不是從起始物質開始?，F(xiàn)在,創(chuàng)造多突變的最佳的方法是同時添加但經(jīng)過統(tǒng)計或生物信息學的方法限制可選項。Codexis研究者使用的一種基于ProSAR(蛋白質結構活性關系)算法的統(tǒng)計相關性的方法將鹵醇脫鹵酶的反應速率提高了4,000多倍。研究者在脫鹵酶中進行隨機的氨基酸替代(大約10個)并測量了變體的催化速率。然后用統(tǒng)計方法識別一個特定的替代是否是有益的。例如,在186位上用Tyr替代Phe的變體平均而言比那些不做替代的要好。一些包含了這樣一種替代的變體并不是有益的,這是由于其它的替代產(chǎn)生了有害的影響。但統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),平均而言,186位上用Tyr替代Phe是一個有益的突變。最后改進的酶在它的254個氨基酸中包含了35個氨基酸替代。γ-蛇麻烯合酶經(jīng)過陽離子中間體催化法呢基二磷酸的環(huán)化生成γ-蛇麻烯僅有45%的產(chǎn)量,另外生成較少量的51種其它倍半萜烯。Keasling及其合作者一步一步地在活性位點替代氨基酸殘基并識別每一個對產(chǎn)物分布的貢獻。將多個替代結合以更有利于另一種倍半萜烯的合成。例如,一種3個替代創(chuàng)造了一種能形成78%的sibirene的酶,天然的酶只能形成23%的sibirene。另一種方法是將改變的位置限制在活性位點上,從序列對比得知,變化的種類一般發(fā)生在這些位點上。Jochens和Bornscheuer使用了這種方法來增加熒光假單胞菌酯酶的立體選擇性。同時改變接近活性位點的底物的4個氨基酸可產(chǎn)生160,000(204)種方法。研究者對比了超過2800個相關酶的氨基酸序列來識別這些位點上哪些氨基酸是最常見的。這些分析將可能性限制到了幾百個變體,然后對這幾百個變體進行測試以發(fā)現(xiàn)具所需選擇性的含兩個或三個突變的變體。另一項可產(chǎn)生多突變的重要進展是認識到突變一般使蛋白質變得不穩(wěn)定,因此從一個很穩(wěn)定的蛋白質開始可使其耐受更大數(shù)目和范圍的改變。因為篩選包括多突變的大文庫的工作量隨文庫大小的增加而呈指數(shù)級增長,大多數(shù)的研究者以有益突變一般具有加和性而協(xié)同效應則很少除非是接近的改變?yōu)楣ぷ骷僭O。事實上,將單個有益突變結合一般產(chǎn)生加和性的進步(例如,增加來自枯草桿菌的酯酶對有機溶劑的穩(wěn)定性或增加來自綠膿假單胞菌的脂肪酶的立體選擇性)。然而,一般這些貢獻并不會精確地相加或擁有始料未及的表現(xiàn)。例如,突變A和突變B自身可能都是有害的,可是合起來后她們可能就是有益的。Weinreich及其合作者研究了β-內酰胺酶向更高的活性進化過程中的這些協(xié)作式的相互作用。突變A增加了反應速率但卻使β-內酰胺酶變得不穩(wěn)定,總體效果是僅有輕微的益處。突變B不影響速率但卻能夠穩(wěn)定β-內酰胺酶,單獨來看它并沒有什么效果。將突變A和突變B放在一起后卻是高度有益的因為β-內酰胺酶變得更快并維持了其穩(wěn)定性,但如果將突變逐步地添加很可能將會錯過這種協(xié)同的例子。Reetz和Sanchis在測試逐步添加突變來增加立體選擇性時得到了相似的結論。當其中一個突變是穩(wěn)定突變且當這些突變彼此靠得很近時協(xié)同作用是很重要的。穩(wěn)定突變造成的不可添加性這一難題能夠經(jīng)過在開始突變前將蛋白質穩(wěn)定使其最小化,可是臨近突變引起的不可添加性難題是最常見也是很難輕易避免的。結果,在蛋白質改進過程中產(chǎn)生的有用的改變的程度在過去十年間急劇增長。在早期,1－5個突變是典型的,而到了,30－40個氨基酸的替代都不是罕見的。例如,生產(chǎn)阿伐她汀(立普妥)側鏈的鹵醇脫鹵酶的定向進化至少改變了254個氨基酸殘基中的35個(>14%),生產(chǎn)西她列汀的轉氨酶的定向進化改變了330個氨基酸中的27個(8.2%)。相似地,逆醛縮酶的計算機設計需要在起始酶中進行8或12個氨基酸替代(4-6%),起始酶是一種含197個氨基酸的木聚糖酶。在過去十年間研究過的第二種方法是創(chuàng)造新的,一般是非天然的,催化活性。這種新的活性的起始點一般是一種催化多功能性反應。催化多功能性指的是一個活性位點催化超過一種反應類型的能力。典型地,酶催化一種正常反應和幾種額外的副反應,這可能涉及常見的催化步驟。新的反應類型不只是一個取代基添加到底物上去,還包括一種不同的轉化狀態(tài)和/或形成不同類型的化學鍵。例如,丙酮酸脫羧酶一般將丙酮酸轉化為乙醛和二氧化碳。然而,丙酮酸脫羧酶的多能催化活性中的一種活性是將乙醛和另一種醛在偶姻縮合中偶聯(lián)。這樣一種非天然的丙酮酸脫羧酶催化的乙醛和苯甲醛的縮合是BASF于1920年代開發(fā)的生產(chǎn)麻黃素藥物前體的工業(yè)方法的基礎。最近的蛋白質工程增強了丙酮酸脫羧酶催化偶姻縮合的多能催化能力。正常反應需要有質子轉移,可是多能催化反應不需要。單氨基酸替代移除質子供體會失去天然活性但使多能催化活性增強大約5倍。用無效不需要的通路來增強需要的產(chǎn)物的通量的方法在第三次飛躍中進一步得到了發(fā)展--代謝通路工程。這使得來自次級代謝的更復雜的通路能被轉移到新的有機體中,并能創(chuàng)造出完全新的生化通路來生產(chǎn)藥物中間體和生物燃料。萜烯、氨基酸和脂肪酸的正常代謝已被重新改造來生產(chǎn)碳氫化合物、乙醇和聚酯纖維以作為燃料、散裝化學品和塑料(見上文)。生物催化劑改造仍面臨的挑戰(zhàn)縱使有顯著進展,但要完全利用生物催化的優(yōu)勢仍存在巨大的挑戰(zhàn)。酶工程較十年前已經(jīng)變快了許多,但改變30-40個氨基酸并從成千上萬個候選物中進行篩選仍需要一個很大的研究團隊。很多,如果不是所有的話,改造策略會產(chǎn)生改進了的變體,但有一些會產(chǎn)生更好的變體并能更快地找到它們。至今還不清楚哪些是更好的策略。對同樣的問題在策略間直接進行比較并測試不同策略背后的假設將會發(fā)現(xiàn)那些最有效的策略。第一個假設是使用酶工程能夠實現(xiàn)目標。涉及非天然底物的反應的熱力學可能要較那些涉及天然底物的反應更不利,而且特定的酶活性的獲得可能在熱力學上是不可能的。擴散效應給反應速率設定了一個上限。在設計新的過程時,非常需要的是,將熱力學和生物催化過程發(fā)展進行更密切的整合。蛋白質工程一般依賴于知曉酶的四級結構,因為在蛋白質－蛋白質界面上的殘基對穩(wěn)定性有貢獻。研究者假設在反應條件下(低酶濃度,高底物濃度,有機溶劑等)酶的結構與結晶酶(高酶濃度,無底物和/或有機溶劑)的結構非常相似。因為大量實驗發(fā)現(xiàn)蛋白質只有在很苛刻的條件下才能結晶,在溶液中,它們很可能采取很多種構象,包括在晶體結構中看到的那些。另外,我們對蛋白質動力學的了解依然很有限,這使得預測變得困難。第三,酶工程假設個體的突變具有加和性。盡管突變一般不會有相互作用,可是很多有相互作用的突變非常有用卻難以研究。識別協(xié)作效應的一種方法涉及使用ProSAR算法進行統(tǒng)計分析,可是要在蛋白質工程早期預測哪些額外突變有可能是加和性的而哪些是死路一條還需要更好的技術。第四,電腦設計新酶的活性不夠精確。設計依然需要測試10-20種預測物且一般產(chǎn)生的是低活性的酶,這些低活性的酶還需要大量的進一步改進。例如,最早的基于計算機設計的用于生產(chǎn)西她列汀的酶每天只能轉化0.1底物分子,然而從晶體結構衍生來的計算機模型中底物與酶的活性位點吻合得正好。新的酶能夠被設計出來以催化在自然界中找不到的反應(Kemp消除反應,新狄爾斯-阿爾德反應),但這樣的活性對實際應用當前還太低。還需要對酶催化的機械、動力和結構方面有更好的了解。技術上的困難同樣限制了生物催化?，F(xiàn)有的DNA合成方法已接近它們的效能極限,但