第十六高效液相色譜法演示文稿

第十六高效液相色譜法演示文稿1本文檔共30頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分優(yōu)選第十六高效液相色譜法本文檔共30頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分液相色譜高柱效的原因:以特殊方法用小粒徑的填料（3～5um球形）制備色譜柱H=He+Hd+Hm+Hs+Hsm=A+B/u+Cmu+Csu+Csmu

由于溶質(zhì)分子在溶劑中的擴(kuò)散系數(shù)很小，縱向擴(kuò)散可以忽略。因此B項(xiàng)可以略去。H=A+（Cm+Cs+Csm）uA=2λdp

2.液相色譜中速率理論0.01k＇2(1+k＇)2

Cm=×dp2

Dm

本文檔共30頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分416-2高效液相色譜儀

流程及主要部件

流程組成系統(tǒng)：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)和記錄系統(tǒng)本文檔共30頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分516-2-1高壓輸液系統(tǒng)

（1）高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性本文檔共30頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分6(2)梯度淋洗裝置內(nèi)梯度:利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。外梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。梯度淋洗：在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們的比例，使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，以提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。本文檔共30頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分716-2-2進(jìn)樣系統(tǒng)

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：本文檔共30頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分816-2-3分離系統(tǒng)

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。本文檔共30頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分916-2-4檢測(cè)器

a.紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。特點(diǎn)：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

本文檔共30頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分10b.光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，可檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。本文檔共30頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分11c.示差折光檢測(cè)器

（differentialrefractiveindexdetector）

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度、流速敏感、不能用于梯度洗脫；

本文檔共30頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分12d.熒光檢測(cè)器

（fluorescencedetector）高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；本文檔共30頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分13高效液相色譜檢測(cè)器UV熒光示差折光蒸發(fā)光散射信號(hào)吸光度熒光強(qiáng)度折光率散射光強(qiáng)流速影響無無無無溫度影響小小大小檢測(cè)限(g/ml)10-1010-1310-710-9梯度洗脫適宜適宜不宜適宜細(xì)管徑柱難難難適宜樣品破壞無無無無通用型否否是是本文檔共30頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分14高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。

本文檔共30頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分151.表面多孔型固定相基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)快速分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2．全多孔型固定相

由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相.

這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速分析。柱容量大，最大允許樣品量是表面多孔型的5倍，特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析.本文檔共30頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分16（二）流動(dòng)相

流動(dòng)相對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)待測(cè)樣品須具有合適的極性和較好的選擇性。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)

溶劑強(qiáng)度指溶劑將組分從色譜柱上洗脫下來的能力。溶劑強(qiáng)度與溶劑的極性有關(guān)。正向色譜中溶劑極性越大溶劑強(qiáng)度越大。反相色譜反之。

本文檔共30頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分17（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。避免與樣品或固定相發(fā)生反應(yīng)或聚合。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。（6）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，若試樣組分的分配比K’值范圍很廣，則采用梯度洗脫。本文檔共30頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分18一、液-固吸附色譜二、液-液分配色譜三、化學(xué)鍵合相色譜四、離子交換色譜五、排阻色譜六、親和色譜(AC)主要分離類型與原理本文檔共30頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分1916-3液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；本文檔共30頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分2016-4液-液分配色譜

liquid-liquidpartition

chromatography固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：（1）全多孔型載體

（2）表面多孔型載體（薄殼型微珠擔(dān)體）（3）固定液極性：β，β-氧二丙腈，聚乙二醇非極性：十八烷（ODS），角鯊?fù)?/p>

本文檔共30頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分2116-5化學(xué)鍵合相色譜

bonded-phasechromatography1．鍵合固定相類型

用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán)

如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團(tuán)

如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)

如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等.本文檔共30頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分22C18硅膠填料結(jié)構(gòu)本文檔共30頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分2316-5化學(xué)鍵合相色譜

bonded-phasechromatography

2.化學(xué)鍵合固定相特點(diǎn)：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；（3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；本文檔共30頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分243．反相健合相色譜法

固定相：極性較小的鍵合固定相，如硅膠-C18H37、硅膠-苯基等；流動(dòng)相：極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛-水、水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等。多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；具有柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。分離機(jī)理：疏溶劑作用。把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性流動(dòng)相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。本文檔共30頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分254.正相鍵合相色譜法固定相:極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2雙羥基等（表16-4）鍵合在硅膠表面；流動(dòng)相:而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為分離極性化合物。主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。5.離子性鍵合相色譜法固定相:當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等；

流動(dòng)相:一般采用緩沖溶液。分離原理與離子交換色譜類同。本文檔共30頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分2616-6離子交換色譜

ion-exchange

chromatography流動(dòng)相：陰離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。本文檔共30頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分27離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別（表16-6）：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）本文檔共30頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\14點(diǎn)27分2816-7排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography

固定相：凝膠(具有一定大