網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)展及其臨床應(yīng)用

概述網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞之間的過(guò)渡階段細(xì)胞，略大于成熟紅細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞剛剛失去核的階段，仍屬未完全成熟的紅細(xì)胞，漿內(nèi)尚殘留有嗜堿性RNA，經(jīng)堿性染料（如天青B、煌焦油藍(lán)或新亞甲藍(lán)）活體染色后，在包體內(nèi)可見藍(lán)色點(diǎn)狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故名網(wǎng)織紅細(xì)胞。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分概述紅細(xì)胞在骨髓中生成，至發(fā)育為成熟紅細(xì)胞，經(jīng)歷了不同階段：干細(xì)胞、原始紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，最后發(fā)育為成熟紅細(xì)胞。隨著細(xì)胞的成熟，RNA含量逐漸減低，至細(xì)胞完全成熟后消失或接近消失，即紅細(xì)胞中網(wǎng)線狀結(jié)構(gòu)越多，表示細(xì)胞越幼稚。ICSH將Ret分為4型：Ⅰ型（絲球型）、Ⅱ型（花冠型或網(wǎng)型）、Ⅲ型（破網(wǎng)型）、Ⅳ型（顆粒型）。正常生理狀態(tài)下，Ⅰ型只存在于骨髓，Ⅱ型在外周血也很難見到，Ⅲ型僅有少量釋放到外周血，因此外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)以Ⅳ型為主。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分概述本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分概述Ret是紅細(xì)胞成熟過(guò)程中的一個(gè)重要階段，是判斷骨髓紅系造血情況和療效觀察的重要指標(biāo)。其檢測(cè)方法既有傳統(tǒng)的顯微鏡目測(cè)法，又有現(xiàn)代化的儀器計(jì)數(shù)法(如流式細(xì)胞儀、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及血細(xì)胞分析儀)。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)展1.手工法2.血細(xì)胞分析儀法3.流式細(xì)胞儀法和專用網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分1.手工法手工法分玻片法和試管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸發(fā)，染色時(shí)間偏短，因此結(jié)果偏低；試管法容易掌握，重復(fù)性較好，必要時(shí)還可以從混合血液中再取標(biāo)本重新涂片復(fù)查。試管法被列為手工法Ret計(jì)數(shù)的參考方法。按衛(wèi)生部《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第2版，采用試管法用煌焦油藍(lán)染液對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞活體染色、制片，選擇細(xì)胞分布較均勻、厚薄適中的體尾交界處，每份標(biāo)本油鏡下參照陳寶梁的建議，即Ret>6%，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞1000個(gè)；3%～5%計(jì)數(shù)紅細(xì)胞2000個(gè)；1%～2%應(yīng)計(jì)數(shù)紅細(xì)胞4000個(gè)；小于1%計(jì)數(shù)紅細(xì)胞10000個(gè)。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分1.手工法傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)數(shù)方法操作較繁瑣、影響結(jié)果的因素較多。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)開始使用國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)推薦的Miller窺盤進(jìn)行計(jì)數(shù)，規(guī)范了計(jì)算區(qū)域，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，使結(jié)果準(zhǔn)確性有所提高(衛(wèi)生部臨檢中心建議，CV控制在15%之內(nèi))。Miller窺盤法是將一種光學(xué)圓片狀Miller窺盤安放在顯微鏡目鏡中，窺盤中有面積比例為1：9的2個(gè)正方形計(jì)數(shù)方格，只需計(jì)數(shù)1／9小方格內(nèi)的紅細(xì)胞即可準(zhǔn)確估量出整個(gè)大方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心控制Ret計(jì)數(shù)CV≤15%需鏡檢的RBC數(shù)目Ret(%)計(jì)數(shù)Miller窺盤小方格RBC相當(dāng)于縮視野法計(jì)數(shù)RBC數(shù)目1-244440003-52222000>61111000本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分1.手工法國(guó)內(nèi)很多學(xué)者在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了幾種改良的Ret計(jì)數(shù)窺盤。張時(shí)民等設(shè)計(jì)了一種雙環(huán)式結(jié)構(gòu)的Ret計(jì)數(shù)窺盤，該盤的特點(diǎn)是小圓環(huán)和大圓環(huán)面積之比為1：10，小圓環(huán)為計(jì)數(shù)紅細(xì)胞數(shù)量，大圓環(huán)為計(jì)數(shù)Ret數(shù)量。其圓形結(jié)構(gòu)更加適合于人們觀察和計(jì)數(shù)顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量的習(xí)慣，而且此比例更加易于計(jì)算紅細(xì)胞和Ret的比值。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分1.手工法陳高遠(yuǎn)則在這兩種窺盤的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了改良式Miller窺盤，采用雙正方形結(jié)構(gòu)，小方格和大方格之比也達(dá)到1：10，只是將紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域位移至中心部位，以方便紅細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分1.手工法劉志賢設(shè)計(jì)了一種新的Ret計(jì)數(shù)窺盤即180×4扇形Ret計(jì)數(shù)窺盤：圓形直徑為19mm，圓心角∠AOB=∠COD=∠EOF=∠GOH=180?；B=CD=EF=GH=180。計(jì)算公式為：Ret%=整個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)的Ret數(shù)／(4個(gè)小扇面區(qū)域內(nèi)的RBC總數(shù)×5)×100％。這種新型Ret計(jì)數(shù)窺盤4個(gè)扇形區(qū)域均勻分布在整個(gè)視野的4個(gè)方向，4個(gè)扇形面積之和是整個(gè)圓形面積的1／5，因此在理論上基本解決了紅細(xì)胞分布不均勻引起的問(wèn)題，降低了系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

手工法網(wǎng)織紅細(xì)胞活體染色染料評(píng)價(jià)染料評(píng)價(jià)新亞甲藍(lán)WHO推薦使用，對(duì)RNA著色強(qiáng)，試劑穩(wěn)定，Hb幾乎不著色煌焦油藍(lán)溶解度低，染料沉渣易附著紅細(xì)胞表面，影響辨認(rèn)；易受變性珠蛋白小體、HbH包涵體干擾中性紅染液濃度低、背景清晰、網(wǎng)織顆粒與紅細(xì)胞對(duì)比鮮明；不受變性珠蛋白小體、HbH包涵體干擾本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2.血細(xì)胞分析儀法1993年以來(lái)，可進(jìn)行Ret計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀相繼問(wèn)世，因其具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，正被越來(lái)越多的醫(yī)院所采用。儀器法Ret計(jì)數(shù)使用各種熒光染料和非熒光染料對(duì)Ret進(jìn)行染色，采用鞘流技術(shù)和射頻技術(shù)等不同原理進(jìn)行檢測(cè)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀不僅可以計(jì)數(shù)Ret，同時(shí)還能檢測(cè)出網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值Ret#、網(wǎng)織紅細(xì)胞平均體積(MRV)、網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)(RMI)等許多參數(shù)，這些參數(shù)是Ret分析、臨床應(yīng)用和研究的熱門領(lǐng)域。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2.血細(xì)胞分析儀法統(tǒng)計(jì)表明，儀器法測(cè)定Ret精密度有明顯提高：對(duì)低Ret標(biāo)本，CV值在10%～21%之間；對(duì)正常范圍的標(biāo)本，CV值在3%～16%之間；高值標(biāo)本，CV值在2%～10%之間。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2.血細(xì)胞分析儀法雖然儀器法Ret計(jì)數(shù)有諸多優(yōu)點(diǎn)，而且精密度明顯優(yōu)于手工法，但也存在一些不足：第一，所有儀器分析的基本原理都是檢測(cè)Ret內(nèi)RNA的存在量來(lái)決定其百分率和絕對(duì)值，當(dāng)某些患者血液中有核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞異常增加時(shí)，可導(dǎo)致Ret計(jì)數(shù)結(jié)果的假性增加；第二，冷凝集素存在、紅細(xì)胞的聚集、某些病理因素或藥物都能使紅細(xì)胞產(chǎn)生自身熒光；第三，自動(dòng)化分析儀結(jié)果的準(zhǔn)確性除了依賴于儀器本身的良好性能外，還應(yīng)有良好的質(zhì)控物隨時(shí)檢測(cè)儀器的狀態(tài)。另外，儀器成本高、價(jià)格貴，基層醫(yī)療單位投入較為困難。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

3.流式細(xì)胞儀法和專用

網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)是一種多用途的精密分析儀器，應(yīng)用派若寧、吖啶橙、噻唑橙等這些特殊的熒光染料與Ret中的RNA結(jié)合，當(dāng)FCM發(fā)出的激光照射于細(xì)胞上時(shí)，根據(jù)細(xì)胞能否發(fā)射出特定顏色的熒光，通過(guò)單參數(shù)定量測(cè)定RNA，從而精確測(cè)定Ret占成熟紅細(xì)胞的比率。還可根據(jù)激光照射后發(fā)射出的熒光強(qiáng)度，或光吸收量大小、光散射量多少等參數(shù)的比例關(guān)系對(duì)Ret成熟程度進(jìn)行分群，將其劃分為低熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞(LFR)、中熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞(MFR)、高熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞(HFR)。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

3.流式細(xì)胞儀法和專

用網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀FCM測(cè)定精密度明顯高于手工法3～6倍，可在數(shù)秒中檢20000個(gè)以上的紅細(xì)胞，如Ret在1.7％～6.6%，其平均CV值在4.3%。不足之處，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)Ret受HOWELL－Jolly小體、瘧原蟲和血小板等干擾。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法學(xué)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)普通顯微鏡法簡(jiǎn)便、成本低，可直觀細(xì)胞形態(tài)；影響因素多，重復(fù)性差玻片法水分易蒸發(fā)，染色時(shí)間短，結(jié)果偏低試管法易掌握，重復(fù)性較好，易復(fù)查Miller窺盤計(jì)數(shù)法規(guī)范計(jì)算區(qū)域，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，ICSH推薦方法儀器法檢測(cè)細(xì)胞多，精密度高，與手工法相關(guān)性好，易標(biāo)準(zhǔn)化。儀器貴；受H-J小體、有核紅細(xì)胞、血小板等干擾本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)的臨床應(yīng)用Ret計(jì)數(shù)及其各種參數(shù)(IRF、RMI、MRV、RPI等)在貧血的診治、骨髓移植、腫瘤的放化療和藥物療效檢測(cè)等方面具有重要參考價(jià)值。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

1．網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的應(yīng)用貧血的恢復(fù)是通過(guò)骨髓釋放紅細(xì)胞生成素(EPO)完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能對(duì)貧血的正常反應(yīng)。失血性貧血時(shí)患者Ret各項(xiàng)指標(biāo)會(huì)顯著增高，失血5～10d內(nèi)Ret可達(dá)高峰，出血停止后2周可恢復(fù)正常，臨床上可應(yīng)用此參數(shù)和特點(diǎn)來(lái)判別出血是否停止；缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血時(shí)也可見患者Ret輕度增加。Ret降低主要和造血功能減低有關(guān)，典型病例為原發(fā)性再生障礙性貧血、溶血性再生障礙性危象；此外還有急性白血病、繼發(fā)性再生障礙性貧血、化療和放療引起的骨髓造血功能抑制或減退等。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2．網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用RPI代表網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成相當(dāng)于正常人的多少倍。不同生理、病理情況下，Ret從骨髓釋放人外周血所需時(shí)間不同，故Ret計(jì)數(shù)值不能確切反映骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)造血功能，還應(yīng)考慮Ret生存期限。通常Ret生存期限約為2d，若未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞提前釋放入血，Ret生存期限將延長(zhǎng)，為了糾正網(wǎng)織紅細(xì)胞提前釋放引起的偏差，用RPI來(lái)反映Ret生成速率。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2．網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用RPI=RET%×被測(cè)HCT/正常人HCT×1/RET成熟天數(shù)。釋放入外周血的網(wǎng)織紅細(xì)胞越趨于幼稚，其成熟時(shí)間越長(zhǎng)。由于網(wǎng)織紅細(xì)胞體積大于成熟紅細(xì)胞，大量網(wǎng)織紅細(xì)胞的提前釋放在某種程度上影響血細(xì)胞比容的測(cè)定結(jié)果。經(jīng)觀察，網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟時(shí)間與Hct存在下列關(guān)系

HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.23﹤0.15Ret成熟時(shí)間(d)11.52.02.53.0本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

2．網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用RPI在估計(jì)紅細(xì)胞生成有效性和貧血起因的分類方法中起到重要作用。Kinetic等應(yīng)用RPI較為準(zhǔn)確地表達(dá)出Ret的成熟狀態(tài)，從而對(duì)貧血的類型進(jìn)行劃分，如健康者平均RPI為1，當(dāng)RPI≥3時(shí)表示紅細(xì)胞生成增加，如溶血性貧血和治療后的營(yíng)養(yǎng)性貧血；而RPI≤2時(shí)為紅細(xì)胞生成減少，如缺鐵性貧血；對(duì)于EPO缺乏、無(wú)效造血等情況時(shí)，RPI多在2～3之間，Kinetic法則還無(wú)法確定。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

3．網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟度(IRF)的應(yīng)用

IRF為不成熟的Ret與總Ret的比值，健康者平均值為0.22，參考范圍0.1～0.38，IRF越大表示不成熟的Ret的數(shù)量越多。這種幼稚Ret水平的改變一般比患者HGB、血小板、白細(xì)胞和臨床癥狀的變化出現(xiàn)更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化療中是與粒細(xì)胞反應(yīng)一致的指標(biāo)和骨髓移植后恢復(fù)的第一信號(hào)。IRF與Ret#和RPI呈一弱的、顯著的正相關(guān)：IRF增加(≥0.23)，一般伴有Ret#增加，提示患者對(duì)于貧血有足夠的紅系反應(yīng)；若IRF＜0.23，且RPI≤2，則說(shuō)明紅系造血活性下降，則以慢性腎功能不全居多；Ret#正?；蚵缘停琑PI≤2，但I(xiàn)RF≥0.23，見于急性感染、鐮狀細(xì)胞性貧血危象、妊娠和MDS等狀況。IRF是評(píng)價(jià)貧血紅系增生活性的一項(xiàng)新的有用的指標(biāo)，IRF結(jié)合Ret#和RPI可以為進(jìn)一步闡明貧血分類提供有價(jià)值的信息。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

4．網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)(RMI)的應(yīng)用該參數(shù)是計(jì)算參數(shù)，可由儀器自動(dòng)計(jì)算，也可將儀器測(cè)定的Ret分群參數(shù)經(jīng)過(guò)人工計(jì)算得到。計(jì)算公式為：RMI=(MFR+HFR)／LFR×100%。文獻(xiàn)報(bào)道RMI的參考范圍，男性：17%～37%，女性：16%～35%。據(jù)報(bào)道，急性白血病化療后Ret#正常而RMI較高，化療中則Ret#和RMI都低；出現(xiàn)溶血危象時(shí)Ret#和RMI都高；ITP則Ret#正常而RMI較高。本文檔共28頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期二\5點(diǎn)48分

5．網(wǎng)織紅細(xì)胞分群的應(yīng)用⑴LF