慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬應(yīng)激性病理效應(yīng)

慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬應(yīng)激性病理效應(yīng)【摘要】目的觀察慢性束縛應(yīng)激下小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)目的改變及天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3的活性，探討應(yīng)激對海馬的損害作用及途徑。方法將16只小鼠隨機分為對照組和應(yīng)激組各8只，采用50ml離心管建立慢性束縛應(yīng)激模型，每晚束縛8min。14d后處死，取小鼠海馬常規(guī)固定制HE片、免疫組化天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3片，在顯微鏡下進行細胞記數(shù)并顯微拍照。結(jié)果慢性束縛應(yīng)激組小鼠海馬數(shù)目較對照組減少，同時天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3陽性細胞率增加()；鏡下神經(jīng)元發(fā)生空泡變性，存在典型凋亡細胞。結(jié)論慢性束縛應(yīng)激海馬神經(jīng)元凋亡蛋白天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3活性增加，天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3可能參與了應(yīng)激狀態(tài)下海馬的細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】束縛應(yīng)激；海馬；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3；病理形態(tài)學(xué)

Stressfulpathologicaleffectsofhippocamalinchronicrestraintstressmice

【Abstract】ObjectiveToobservechangesofhippocamalneuronsandactivitiesofCaspase3inthehippocampusofchronicrestraintstressmiceandexploretheinjuringactionsandwaysofstresstohippocampus.Methods16micewererandomlydividedintocontrolandstressfulgroup(bothn=8),RSTdeviceswereconstructedwith50mlpolypropyleneconicaltubes,restrainstresswasimposedfor8minutespernight.AfterFourteendaysmicewerekilledandbrainsweretaken.TheparaffinsectionfortheHeandimmunohistochemistryCaspase3wereroutinelymade,countsofpositivecellandphotomicrographstakenundermicroscope.ResultsDecreaseofhippocamalneuronsweremoremarkedinthestressthaninthecontrolgroup()andrateofpositivecellofCaspase3increasedmoresignificantly();Neuronsdevelopedvacuolardegenerationandhaddeadcells.ConclusionActivityofhippocamalCaspase3increasedandCaspase3mightplayaroleinthedeathofhippocamalneuronsunderstress.

【Keywords】Restraintstress;hippocampus;Caspase3;pathomorphism.

慢性持久的不良刺激對大腦可產(chǎn)生病理生理損害。流行病學(xué)資料顯示,慢性應(yīng)激與很多精神障礙如復(fù)發(fā)性抑郁癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumaticstressdisorder,PTSD)的發(fā)病密切相關(guān)［1,2］。國外有資料表明,慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致動物海馬CA1和CA3區(qū)錐體細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)受損,并認為這可能與隨后發(fā)生的精神障礙有關(guān)。新近的研究發(fā)現(xiàn)［3］,天冬氨酸特異性半光氨酸蛋白酶3(Caspase3)參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。本研究通過建立慢性束縛應(yīng)激模型，觀察海馬腦組織的形態(tài)學(xué)改變，并半定量檢測海馬Caspase3活性，探討慢性應(yīng)激對海馬的病理損害。

1材料與方法1試劑器材兔抗小鼠Caspase3抗，購于武漢博士德公司；ULTRASENSITIVETMSP超敏試劑盒，購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；75%酒精，4%多聚甲醛，DAB顯色液，50ml離心管，奧林巴斯顯微攝像顯微鏡，COINC光學(xué)顯微鏡等。2分組處理昆明小白鼠，周齡4～6w,體重19±2g，由蘇州大學(xué)試驗動物中心提供。將實驗小鼠隨機分為對照組(NC)和應(yīng)激組(SS)，每組8只，實驗前對照組和應(yīng)激組在相同的環(huán)境下適應(yīng)1w，溫度20℃，濕度60%?；\舍為標(biāo)準(zhǔn)潔凈的嚙齒動物籠，墊料為木屑，每5d換1次墊料。操作流程依次將小鼠放入50ml離心管中，可前后排列［4］。8h后將動物放出，恢復(fù)自由,供食物和水，全部動物在應(yīng)激時間禁食禁水，應(yīng)激5次?w-1，共2w。3標(biāo)本制作在應(yīng)激10次后，摘眼球放血處死小鼠，取大腦，于4%多聚甲醛中固定，海馬取視交叉至乳頭體組織［5］，行石蠟切片，制作HE及免疫組化染色，切片厚度8um。高倍鏡下(400x)對海馬CA1、CA2、CA3和DG區(qū)錐體細胞進行雙盲法計數(shù)(CA1、CA2區(qū)選取細胞數(shù)較為恒定的中段)。每張切片取連續(xù)的兩個視野,并保證錐體細胞層的弧度弦置于目鏡的直徑上,取兩視野的平均值為該切片錐體細胞數(shù),5張切片的平均值為該樣本的錐體細胞數(shù)［6］。腦片室溫下晾干,沖洗,加入Caspase3單克隆抗體,4℃過夜,沖洗,加生物素標(biāo)記的二抗工作液,37℃1ｈ,?LPBS沖洗,加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37℃1ｈ,?LPBS沖洗,DAB顯色。用圖像分析儀,對免疫組化結(jié)果進行光密度掃描,計算平均光密度值。4統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±ｓ)表示。兩組海馬細胞數(shù)比較采用ｔ檢驗,應(yīng)激后海馬神經(jīng)細胞Caspase3表達比較采用方差分析。

2結(jié)果

應(yīng)激小鼠行為觀察小鼠在束縛后起初幾日表現(xiàn)為梳毛增多，敏感、煩躁,易激惹,進食減少，同伴之間常有廝打。第二個束縛周期開始后，小鼠表現(xiàn)為逐漸少動，喜歡蜷縮在一起，毛發(fā)蓬松,缺乏光澤，順從，激惹呈回避反應(yīng)。

應(yīng)激后小鼠腎上腺皮質(zhì)組織學(xué)變化,見圖1。

圖1正常腎上腺HE200應(yīng)激腎上腺HE200

NC組皮質(zhì)球狀帶結(jié)構(gòu):細胞排列緊密,呈不規(guī)則索狀,呈圓形或橢圓形；核大且位于中央,染色深。皮質(zhì)束狀帶結(jié)構(gòu):細胞成放射狀,細胞較球狀帶大,呈多邊形和圓形；胞核淡染。皮質(zhì)網(wǎng)狀帶:細胞呈多邊形,細胞索互相吻合形成網(wǎng)狀,索間有血竇；胞核小,間質(zhì)多,核大。

SS組腎上腺皮質(zhì)球狀帶:細胞排列不規(guī)則,呈團塊狀和索狀,細胞呈圓形或橢圓形；核小,位于中央,染色深。皮質(zhì)束狀帶結(jié)構(gòu):細胞基本失去平行或呈網(wǎng)狀排列,細胞呈圓形或橢圓形；細胞索之間有血竇和少量結(jié)締組織；胞核大且染色淺；胞質(zhì)含多量的脂質(zhì)顆粒,有的細胞有脫顆?，F(xiàn)象。腎上腺網(wǎng)狀帶:細胞呈多邊形,較小；細胞索相互吻合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；胞核小,染色深。

應(yīng)激對海馬的影響

光鏡HE觀察與神經(jīng)元記數(shù)NC組小鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元均成規(guī)則構(gòu)筑樣排列,SS組海馬各區(qū)神經(jīng)元有不同程度的丟失，CA1、A2區(qū)最明顯，CA3區(qū)次之，DG丟失最少?？梢娚窠?jīng)元脫失,部分核固縮深染,裂解成碎片狀,或細胞變性、溶解(圖2)。兩組海馬各區(qū)神經(jīng)元記數(shù)比較見表1。

表1兩組海馬各區(qū)神經(jīng)元記數(shù)比較

注：與NC比較△P＜；與NC比較*P＜

表1顯示,兩組海馬CA1、CA2區(qū)神經(jīng)元記數(shù)比較差異有極顯