小鼠IL12基因轉(zhuǎn)染對人卵巢癌Skov3細胞的生長及細胞因子的表達

小鼠IL12基因轉(zhuǎn)染對人卵巢癌Skov3細胞的生長及細胞因子的表達【摘要】目的：觀察含小鼠IL12全長基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Skov3人卵巢癌細胞中，在脾細胞存在的情況下對腫瘤細胞的影響及相關(guān)細胞因子的表達.方法：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將基因轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細胞中，ELISA方法檢測IL12及INFγ的表達，MTT方法檢測對Skov3卵巢癌細胞增殖的影響.結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48h檢測到IL12的高表達，約(473±38)ng/L；而未轉(zhuǎn)染組約13~17ng/L，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義.在脾細胞作用下產(chǎn)生INFγ，以作用后24h表達量高，約(173±18)ng/L，較未轉(zhuǎn)染組高，比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜).轉(zhuǎn)染后癌細胞免疫組化可見IL12表達，在脾細胞的作用下，IL12對Skov3卵巢癌細胞有抑制其增殖的作用(P＜).結(jié)論：可以將IL12基因轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細胞中并表達IL12，脾細胞檢測其活性并有相應(yīng)的細胞因子產(chǎn)生，對Skov3細胞有抑制其增殖作用，從而殺傷卵巢癌細胞，具有抗腫瘤作用.

【關(guān)鍵詞】白細胞介素12；卵巢腫瘤；基因治療

0引言

腫瘤生物學(xué)治療的許多細胞因子中IL12是最有效的［1］.它具有明顯的抗原發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤的作用，且毒性遠比IL2低，成為廣大學(xué)者研究的熱點之一.卵巢惡性腫瘤在盆腔內(nèi)生長，易于轉(zhuǎn)移而廣泛播散，復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率均較高.楊紅等［2］將β葡萄糖醛酸苷酶基因轉(zhuǎn)入卵巢癌細胞以探索卵巢癌臨床基因治療.我們將含有小鼠IL12全長基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Skov3人卵巢癌細胞中，觀察其表達情況及其相關(guān)細胞因子的表達，評價其抗腫瘤效果，探討臨床應(yīng)用的可行性.

1材料和方法

材料人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌Skov3細胞株用含100mL/L小牛血清的RPMI1640(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，在37℃，50mL/LCO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細胞長滿單層后用g/L胰蛋白酶消化傳代.含有全長小鼠IL12質(zhì)粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大腸桿菌；成年KM小鼠2只，購于黑龍江省腫瘤研究所實驗動物中心；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Roche公司產(chǎn)品.

方法將已經(jīng)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒［PCAGGSIL12(kb)［PCAGGSIL12P35TRESIL12P40］的大腸桿菌菌株加入LB培養(yǎng)基5mL中，置于37℃搖床中24h，傳代過夜，見培養(yǎng)基較渾濁后進行提取，-20℃保存并取25μL質(zhì)粒溶液加入蒸餾水1mL中，分光光度計260，280nm下觀察A值，得到質(zhì)粒的濃度和純度.DNA濃度公式：c(mg/L)=A260nm/;DNA純度公式：A260nm/A280nm.將Skov3細胞制成單細胞懸液，以1×106接種于6孔板中.貼壁后，用不含血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液洗板3次，將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的混合液輕輕混勻放置10min后將混合液加入6孔板中，設(shè)無小鼠IL12基因的空白質(zhì)粒為對照.置37℃,50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)，6h后更換含100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液，于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)染.收獲不同時間的培養(yǎng)上清按小鼠IL12ELISA試劑盒說明建立標準曲線，于轉(zhuǎn)染后24，48，60h檢測上清IL12表達水平.以未轉(zhuǎn)染的Skov3為對照.

取成年KM小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，加RPMI1640培養(yǎng)液3mL混勻培養(yǎng)，稀釋10倍后細胞記數(shù)器記數(shù)：C=(A+B+C+D)/4×10×104.吸取轉(zhuǎn)染后48h的上清，加入脾細胞懸液中，培養(yǎng)0，24，48h，分別檢測INFγ表達；收集轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細胞，將脾細胞懸液加入其中，共同培養(yǎng)24，48h后，收集上清，檢測INFγ表達.以未轉(zhuǎn)染的Skov3A值為對照MTT法檢測Skov3卵巢癌細胞抑制率=［/A對照組］×100%

統(tǒng)計學(xué)處理：全部數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件SPSS處理，組間比較用方差分析，為有統(tǒng)計學(xué)意義.

2結(jié)果

質(zhì)粒濃度=μg/L；DNA純度：A260nm/A280nm=轉(zhuǎn)染后Skov3細胞光鏡下形態(tài)未見明顯變化.

小鼠IL12的表達轉(zhuǎn)染后24，48及60hIL12表達水平分別為75±9，473±38，522±32；而未轉(zhuǎn)染組分別為13±4，16±4，17±6.轉(zhuǎn)染后組IL12表達水平較未轉(zhuǎn)染組明顯增高，48和60h的表達有統(tǒng)計學(xué)差異.

γ的表達轉(zhuǎn)染后48h上清與脾細胞懸液共同培養(yǎng)作用0，24，48h，ELISA方法檢測得INFγ的表達水平分別為：±，±，±，其中共同作用24hINFγ表達水平較高；轉(zhuǎn)染48h后Skov3卵巢癌細胞中加入脾細胞懸液，共同培養(yǎng)24，48h后，收集上清檢測INFγ的表達，測得INFγ表達水平分別為：±，±轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細胞與脾細胞共同作用24h后可測得高水平INFγ的表達.提示轉(zhuǎn)染后Skov3的卵巢癌細胞持續(xù)分泌的IL12能促進效應(yīng)細胞產(chǎn)生持續(xù)高水平的INFγ表達.脾細胞與轉(zhuǎn)染后Skov3的卵巢癌細胞共同作用24h后，A490nm為±，與未轉(zhuǎn)染的Skov3卵巢癌細胞A490nm±比較有差異；與未轉(zhuǎn)染的Skov3+S作用后的A490nm值±比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義.而TSkov3，Skov3，Skov3+S，Skov3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義.轉(zhuǎn)染后的Skov3卵巢癌細胞與脾細胞共同作用24h后，對卵巢癌的抑制率為%，表明在脾細胞存在共同作用下小鼠IL12對Skov3卵巢癌細胞的增殖有明顯的抑制作用.

3討論

細胞因子療法是腫瘤生物療法之一.Yamazaki等［3］將含有鼠IL12基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到BCG中，發(fā)現(xiàn)能夠檢測到IL12,INFγ的高表達并且增加了BCG的腫瘤殺傷效應(yīng).王克敏等［4］將含有小鼠IL12基因與MHCI基因的質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染到肝癌細胞株中，用ELISA方法測得上清中小鼠IL12表達為48ng/L.我們以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有鼠全長IL12基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Skov3卵巢癌細胞中，脂質(zhì)體作為治療基因載體較病毒載體的優(yōu)點是安全、操作簡單、轉(zhuǎn)染成功率較高,但轉(zhuǎn)染率較低，因此IL12表達水平不是特別高，較相關(guān)文獻報道水平低.

INFγ具有較強的抗腫瘤作用［5-6］,能夠抑制腫瘤生長，并能抑制機制轉(zhuǎn)移蛋白酶，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移.IL12通過誘導(dǎo)INFγ的產(chǎn)生，抑制腫瘤.

本實驗結(jié)果顯示在部分效應(yīng)細胞脾細胞的存在下，小鼠IL12對卵巢癌細胞的抑制殺傷作用，并檢測了相應(yīng)的效應(yīng)因子的表達，初步探討了其在卵巢癌細胞中的抗腫瘤作用.由于細胞因子間相互作用是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，本研究中的細胞因子種類有限，不能全面解釋IL12的抗卵巢癌作用，尚需繼續(xù)完善.

【參考文獻】

［1］GorelikE,EdwardsRP,FengX,etal.IL12receptormediatedupregulationofFasLinhumanovariancarcinomacells［J］.IntJCancer,2004,112(4):620-627.

［2］楊紅，辛?xí)匝啵匦l(wèi)軍.β葡萄糖醛酸苷酶基因轉(zhuǎn)染人卵巢癌細胞的生物學(xué)特性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2003,24:1575-1577.

［3］YamazakiM,ZhangR,StrausFH,etal.Effectivegenetherapyformedullarythyroidcarcinomausingrecombinantadenovirusinducingtumorspecificexpressionofinterleukin12［J］.GeneTher,2002,9(1):64-74.

［4］王克敏，夏愛娣，陳詩書.質(zhì)脂體介導(dǎo)Mil12基因與MHCⅠ基因聯(lián)合對小鼠試驗性肝癌的治療作用［J］.癌癥,2002,21:1041-1046.

［5］ComesA,CarloED,MusianiP,etal.IFNγindependentsynergisticeffectsofIL12andIL15induceantitumorimmuneresponsesinsyngeneicmice［J］.EurJImmunol，2002,32(7):1914-1923.

［6］YunCH,LundgrenA,AzemJ,etal.Na