幽門螺桿菌cagA基因?qū)ξ赴┘?xì)胞影響

幽門螺桿菌cagA基因?qū)ξ赴┘?xì)胞影響

【關(guān)鍵詞】幽門螺桿菌；CagA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

摘要：目的觀察幽門螺桿菌野生株與cagA基因同源缺失突變株對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823的細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討與Hp毒力基因cagA相關(guān)的細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)。方法將幽門螺桿菌野生株與cagA基因缺失突變株與BGC823細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在6，12，24和48h觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用四甲基偶氮噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果野生株和突變株Hp攻擊BGC823細(xì)胞6h，即可引起細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，48h時(shí)均可觀察到細(xì)胞形態(tài)呈分散及蜂鳥樣改變。MTT法檢測(cè)顯示，野生株對(duì)BGC823細(xì)胞增殖具有抑制作用，而缺失cagA基因的突變株可刺激細(xì)胞增殖，且在24，48h的2個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于對(duì)照組和野生株組。流式細(xì)胞分析顯示，在攻擊BGC823細(xì)胞48h后，野生株和突變株均可引起細(xì)胞凋亡，凋亡率高于對(duì)照組，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Hp作用后細(xì)胞呈分散和蜂鳥樣改變并不是cagA基因特有的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)；cagA基因是Hp抑制細(xì)胞增值所必需的元素；cagA基因的有無(wú)對(duì)Hp致凋亡效應(yīng)的影響不大，在Hp致細(xì)胞凋亡的效應(yīng)中作用可能有限。

關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌；CagA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

EffectsofcagAgeneofhelicobacterpylorionBGC823cells

Abstract:objectiveToobservetheeffectsofacagA-deletedmutantstrainofChineseonthephenotypes,proliferationandapoptosisinhumangastriccancercelllineBGC823invitro,andtodeterminethecytotoxicityofcagA,oneofthevirulencegeneofBGC823cellswereco-culturedwiththewildtypeandtheisogenousmutant,whichwerecalledthewildtuestraingroupandthemutantstaingroup,cellphenotypewasobservedat6,12,24and48handthecellularproliferationwasexaminedbymethylthiazolyltetrazolium(MTT)inductionofapoptosiswasdeterminedbyflowThechangesofcellmorphologywereobservedwhenBGC823cellswereco-culturedwithfor6hours,andcellscatterringandhummingbirdmorphology(cellelongation)werepresentedafterco-culturedfor48hoursinbothMTTassayshowedthattheviabilityofBGC823cellswasinhibitedinthewildtypestraingroup,whilewassignificanthigherinthemutantstraingroupthanthatofthecontrolgroupandthewildtypestraingroupwhenco-culturedwithfor24and48hours,demonstratedbyflowcytometry,theapoptoticrateinboththewildtypeandthemutantgroupwashigherthanthatofcontrolgroup(),buttherewasnodifferencebetweenthetwogroupstreatedwithConclusionsCellscatterringandhummingbirdphenotype(cellelongation)werenotthecellmorphologycharacteristicsspecificrelatedtothecagAgeneaftertreatedwith;ThecagAgenemayplaythecrucialrolein‘sactionsofinhibitingcellularproliferation;ThecagAgenemayhavetheonlylimitedeffectsonthecellularapoptosisinducedby

Keywords:helicobacterpylori;cagA;cellproliferation;apoptosis

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種可長(zhǎng)期定植于人類胃粘膜的革蘭陰性微需氧菌，在全世界范圍內(nèi)感染率超過(guò)50%。Hp是引起萎縮性胃炎和胃潰瘍等慢性炎癥的致病因子，流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Hp慢性感染是導(dǎo)致胃癌的重要危險(xiǎn)因素，世界衛(wèi)生組織已將其列為一類致癌原〔1〕。然而Hp確切的致癌機(jī)制至今仍不清楚。細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(cytotoxinassociatedgeneA，CagA)是Hp重要的毒力因子之一。流行病學(xué)研究認(rèn)為，CagA陽(yáng)性Hp感染與消化性潰瘍和胃癌發(fā)生的關(guān)系比CagA陰性菌株更為密切，提示cagA在Hp致病過(guò)程中可能具有重要作用〔2,3〕。世界范圍內(nèi)不同Hp菌株CagA分子變異較大，該變異可能導(dǎo)致不同菌株的CagA生物學(xué)作用乃至致病性不同〔4〕。我國(guó)作為Hp感染較嚴(yán)重的國(guó)家之一，臨床分離株中超過(guò)90%含有cagA基因，但對(duì)于毒力因子CagA的生物學(xué)功能不甚明了。另外，由于cagA陽(yáng)性野生株與cagA陰性自然突變株之間缺乏除cagA基因以外的相同遺傳背景，所以無(wú)法對(duì)cagA基因功能做出真實(shí)判斷。為此，本室在自行構(gòu)建的幽門螺桿菌中國(guó)株cagA基因缺失突變株的基礎(chǔ)上，探討野生株與突變株對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在揭示與Hp毒力基因cagA相關(guān)的細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)。結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

11材料菌株與細(xì)胞株：幽門螺桿菌野生株MEL-Hp27(Hp27)為本教研室從鄭州市慢性萎縮性胃炎患者體內(nèi)分離并保種；cagA基因缺失突變株MEL-Hp27△cagA為本室自行構(gòu)建，cagA基因被完全敲除掉，代之以卡那抗性基因；低分化胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院周慧聰博士惠贈(zèng)。試劑與儀器：四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)；FTTC-AnnexinV/PI標(biāo)記液；紫外分光光度計(jì)。酶標(biāo)儀；流式細(xì)胞儀。

12方法

121Hp的培養(yǎng)將野生株MEL-Hp27和突變株MEL-Hp27△cagA分別接種于含10％羊血的布氏平板培養(yǎng)基，37℃、微需氧條件下培養(yǎng)，3d后收集細(xì)菌，用PBS制成細(xì)菌懸液，在分光光度計(jì)上測(cè)定細(xì)菌濃度，然后用含10％胎牛血清的無(wú)抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整適當(dāng)濃度用于攻擊細(xì)胞。

122BGC823細(xì)胞培養(yǎng)BGC823細(xì)胞的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的無(wú)抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液，細(xì)胞置于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

123BGC823細(xì)胞與Hp共培養(yǎng)BGC823細(xì)胞于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換用含Hp的細(xì)菌懸液，置于37℃微需氧環(huán)境中共培養(yǎng)；對(duì)照組只含10％胎牛血清的無(wú)抗生素RPMI-1640培養(yǎng)液；野生株組和突變株組細(xì)菌與細(xì)胞的比例均為100∶1。

124細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察BGC823細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于24孔板中，分別于細(xì)菌與細(xì)胞共同培養(yǎng)的6，12，24，48h對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

125細(xì)胞增殖測(cè)定采用MTT法，細(xì)胞以5×103/孔密度接種于96孔板上，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別在細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)的12，24，48h于每孔加入MTT20μl，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO150μl，室溫避光搖床上充分振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A492nm吸光度(A)值并記錄結(jié)果。

126細(xì)胞凋亡測(cè)定細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板上，置于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換用含Hp的細(xì)菌懸液，置于CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。在細(xì)胞與細(xì)菌共培養(yǎng)48h后，胰酶消化細(xì)胞，1000r/min離心10min,收集細(xì)胞,冷PBS洗3遍，以FTTC-AnnexinV/PI雙標(biāo)記后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)，該方法能區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死(PI標(biāo)記)細(xì)胞。

2結(jié)果

21細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖1可見(jiàn)，人胃癌細(xì)胞BGC823株經(jīng)野生株和突變株Hp攻擊

后，均出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，并隨Hp與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化越明顯。對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，輪廓清晰，呈多邊形，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少。而野生株和突變株Hp攻擊細(xì)胞6h，即可見(jiàn)細(xì)胞周邊有較多細(xì)菌附著,細(xì)胞有脫壁現(xiàn)象，培養(yǎng)液中可見(jiàn)細(xì)胞崩解后的殘留顆?；蚓w；培養(yǎng)48h后，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)呈分散及蜂鳥樣改變。

圖1Hp與細(xì)胞共培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

22細(xì)胞增殖活性(表1)表1可見(jiàn)，在Hp與細(xì)胞共培養(yǎng)的12h，野生株和突變株組細(xì)胞的增殖活性與對(duì)照組相比差別不大；培養(yǎng)24h時(shí)各組細(xì)胞增值活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中突變株組細(xì)胞增值活性明顯高于野生株組和對(duì)照組，野生株組細(xì)胞增值受抑制，明顯低于對(duì)照組；培養(yǎng)48h時(shí)各組細(xì)胞增值活性差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較顯示，突變株組細(xì)胞增值活性高于野生株組和對(duì)照組。

表1Hp與BGC823細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的MTT值

注:與對(duì)照組比較,*P0005；與對(duì)照組及野生組比較,**P005

23細(xì)胞凋亡率以100:1的細(xì)菌與細(xì)胞比例共培養(yǎng)48h后,流式細(xì)胞儀分析顯示，野生株組和突變株組細(xì)胞凋亡率分別為843%和913%，均高于對(duì)照組凋亡率273%,但2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2各組凋亡率比較

3討論

由于Hp菌株自身的變異，cagA陽(yáng)性株與cagA陰性株間除cagA基因外存在許多差異，在自然狀態(tài)下很難對(duì)cagA基因功能做出真實(shí)判斷。為此，本室自行構(gòu)建了幽門螺桿菌中國(guó)株cagA基因缺失突變株，并在此基礎(chǔ)上觀察了遺傳背景相同的野生株與突變株對(duì)人胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期揭示cagA基因細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Hp與細(xì)胞共培養(yǎng)6h即可觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，在培養(yǎng)48h后，均可導(dǎo)致細(xì)胞的分散或蜂鳥樣改變，與Stefan等〔5〕的報(bào)道相似。但是未發(fā)現(xiàn)野生株與cagA基因缺失突變株對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響存在差異，可見(jiàn)，cagA基因缺失仍然可以造成與野生株作用相似的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，提示Stein等〔6〕報(bào)道的cagA基因引起的細(xì)胞分散和蜂鳥樣改變的效應(yīng)可能并不是cagA基因所特有的作用。野生株與突變株雖然可以引起相似的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，二者的作用機(jī)制也可能不同。本研究結(jié)果顯示，野生株對(duì)BGC823細(xì)胞具有抑制作用，而缺失cagA基因的突變株卻可刺激細(xì)胞增殖，且在24，48h2個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都高于對(duì)照組和野生株組。由此可見(jiàn)，cagA基因在Hp抑制細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，甚至是必需的元素。至于cagA基因缺失后Hp為何促進(jìn)細(xì)胞增殖，還有待于進(jìn)一步研究。細(xì)胞凋亡在維持胃腸道粘膜組織的完整性中起著非常重要的作用，細(xì)胞凋亡與增殖之間的動(dòng)態(tài)平衡是上皮細(xì)胞更新循環(huán)、維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑〔7〕。佘菲菲等〔8〕在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CagA蛋白，并研究了cagA和凋亡的關(guān)系，認(rèn)為CagA可以誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡。但由于是通過(guò)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CagA蛋白，與Hp在自然情況下攻擊細(xì)胞的情形不同，且只能分析cagA本身在細(xì)胞內(nèi)的作用，不能全面揭示與cagA相關(guān)的生物學(xué)功能，因此，對(duì)cagA基因功能的評(píng)價(jià)并不完全。本研究結(jié)果顯示，野生株和cagA基因缺失突變株在與細(xì)胞共培養(yǎng)48h后均可引起細(xì)胞凋亡，但2組凋亡率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示cagA基因在Hp誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中作用有限，cagA基因有無(wú)對(duì)Hp致凋亡效應(yīng)的影響并不大，即CagA可能不是Hp誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞與細(xì)菌共同培養(yǎng)技術(shù)建立了體外Hp急性感染的細(xì)胞模型，并且比較了中國(guó)幽門螺桿菌野生株與cagA基因同源缺失突變株對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC823細(xì)胞的影響，進(jìn)一步豐富了有關(guān)中國(guó)幽門螺桿菌cagA基因功能的研究?jī)?nèi)容。本研究發(fā)現(xiàn)，Hp作用后細(xì)胞呈分散和蜂鳥樣改變并不是cagA基因特有的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)；cagA基因是Hp抑制細(xì)胞增值所必需的元素；cagA基因在Hp致細(xì)胞凋亡的效應(yīng)中作用可能有限。

參考文獻(xiàn)

〔1〕Radosz-KomoniewskaH,BekT,JozwiakofHelicobacterpyloriinfection［J］.ClinMicrobiolInfect,2005,11(8):602-610.

〔2〕RuggeM,BusattoG,CassaroM,etyoungerthan40yearswithgastriccarcinomaHelicobacterpylorigenotypeandassociatedgastritisphenotype［J］.Cancer,1999,85(12):2506-2511.

〔3〕NomuraM,LeeJ,StemmermannGN,etpyloriCagAseropositivityandgastriccarcinomariskinaJapaneseAmericanpopulation［J］.JInfectDis,2002,186