幽門(mén)螺桿菌與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石的關(guān)系

幽門(mén)螺桿菌與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石的關(guān)系【摘要】目的研究幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石(primaryintrahepaticstones，PIS)之間的關(guān)系。方法采用PCR法檢測(cè)膽汁及肝內(nèi)膽管黏膜組織中HpDNA；采用改良fishman法檢測(cè)β葡萄糖醛酸苷酶(βGlucuronidase,βG)。結(jié)果37例PIS患者膽汁及膽管黏膜行HpDNAPCR檢測(cè)，總陽(yáng)性數(shù)為26例(%)，而對(duì)照組膽汁中HpDNA僅1例陽(yáng)性，Hp感染率兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。PIS患者有Hp感染者與無(wú)Hp感染者外源性βG比較無(wú)明顯差異，然而內(nèi)源性βG升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論P(yáng)IS與Hp感染相關(guān)，并且Hp可能通過(guò)內(nèi)源性βG途徑參與PIS的形成。

【關(guān)鍵詞】幽門(mén)螺桿菌；β葡萄糖醛酸苷酶；膽管結(jié)石

【Abstract】ObjectiveTostudypathogenicmechanismofhelicobacterpylori(Hp)infectioninprimaryintrahepaticstones(PIS).MethodsHpDNAinbileandmucosaofPISsampleswasdetectedbyPCRwhileactivityofβglucuronidase(βG)measuredbyenzymologicalmethod.ResultsPCRshowedthat26cases(%)hadpositiveHpDNAinbileandbileductmucosaof37caseswithPIS;buttherewasonly1casewithpositiveHpDNAinthecontrol,withstatisticalsignificanceuponinfectionrateofHpbetweentwogroups().PIScasesincludedthoseinfectedwithorwithoutHp.TherewasnostatisticaldifferenceuponexogenousβGactivitybutstatisticaldifferenceuponendogenousβGactivitybetweenpositiveHpDNAandnegativeHpDNA.ConclusionPISinvolvesHpinfectionagentsthatmayaccelerateformationofPISbyenhancingactivityofendogenousβGactivity.

【Keywords】Helicobacterpylori;βGlucuronidase;Intrahepaticstones

膽汁中幽門(mén)螺桿菌(helicobacterpylori,Hp)DNA的發(fā)現(xiàn)使得Hp與肝膽疾病的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)［1-3］。但是，目前關(guān)于Hp與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石(primaryintrahepaticstones,PIS)之間的關(guān)系報(bào)道較少。為進(jìn)一步探討Hp與PIS之間可能存在的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

1材料與方法

標(biāo)本采集

選取病例均排除肝硬化和肝癌等疾病。PIS組37例，其中男22例，女15例；平均年齡歲(33～73歲)。17例為左肝內(nèi)膽管結(jié)石，伴膽管炎者9例；8例為右肝內(nèi)膽管結(jié)石，伴膽管炎者5例；左右肝內(nèi)膽管結(jié)石者12例，伴膽管炎者6例。對(duì)照組8例，其中肝血管瘤2例，膽道損傷1例，壺腹部周?chē)?例。開(kāi)腹后穿刺抽取肝門(mén)部膽管膽汁1ml立即送需氧、厭氧和Hp培養(yǎng)，另取2～3ml膽汁置滅菌管內(nèi)，行肝葉切除者取肝組織及肝內(nèi)膽管黏膜組織各約cm×cm置滅菌管內(nèi)，標(biāo)本均立即置-80℃冰箱保存。

材料

采用UreA引物，其核苷酸序列為：HpU1，5′CATCTCCCCCCCAACAAATC3′；HpU2，5′TTCACCACACGACCCATA3′，由上海生物工程公司合成和純化。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為697bp。βG測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。組織DNA抽提試劑盒購(gòu)自中美合資優(yōu)晶生物工程有限公司。

方法

細(xì)菌培養(yǎng)：膽汁和膽管黏膜即刻接種行厭氧菌、需氧菌及幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)。

HpDNA的檢測(cè)：(1)Hp陽(yáng)性對(duì)照來(lái)源于胃癌手術(shù)患者胃黏膜組織(術(shù)前胃鏡檢查尿素酶實(shí)驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性)。(2)HpDNA的抽提：應(yīng)用組織DNA抽提試劑盒提取膽汁和黏膜勻漿中DNA。(3)HpDNAPCR擴(kuò)增反應(yīng)：總反應(yīng)體積為25μl。其中模板量為1μl，熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶μl(5U/μl)，10×PCR緩沖液μl，10μmol/L上下游引物各為1μl，10mmol/LdNTP2μl，25mmol/LMgCl2μl，加無(wú)菌去離子水至25μl。在DNA熱循環(huán)儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)上，94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s，50℃退火50s，72℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10min。(4)經(jīng)%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄。

βG的測(cè)定：應(yīng)用南京建成生物公司的βG測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別測(cè)定內(nèi)、外源性βG。酶單位定義為：每毫克肝臟蛋白或每毫升膽汁在37℃條件下，每分鐘能催化生成1μmol酚酞的酶量就是1個(gè)酶活力單位。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料組間比較采用ｔ驗(yàn)檢，分類(lèi)資料分析采用χ2檢驗(yàn)。為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

Hp檢測(cè)結(jié)果

37例PIS患者膽汁中均未培養(yǎng)出Hp。37例PIS患者行HpDNAPCR檢測(cè)，膽汁中HpDNA陽(yáng)性22例，膽管黏膜組織中HpDNA陽(yáng)性13例，其中膽汁及膽管黏膜組織中HpDNA均陽(yáng)性者9例，膽管黏膜組織HpDNA陽(yáng)性而膽汁HpDNA陰性4例。PIS組HpDNA總陽(yáng)性數(shù)為26例，對(duì)照組8例膽汁中HpDNA僅1例陽(yáng)性。見(jiàn)圖1、表1。

陽(yáng)性對(duì)照；2.膽管黏膜陽(yáng)性結(jié)果；3.膽汁陽(yáng)性結(jié)果；4.膽汁陰性對(duì)照由表1可知，PIS組較對(duì)照組HpDNA檢測(cè)結(jié)果有差異，兩組之間的Hp感染率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。

βG檢測(cè)結(jié)果

表2和表3對(duì)βG檢測(cè)結(jié)果按照其他普通細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果及HpDNAPCR結(jié)果進(jìn)行分層檢驗(yàn)，以排除其他普通細(xì)菌對(duì)βG檢測(cè)結(jié)果的干擾。其他普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性的患者中HpDNA陽(yáng)性者與陰性者之間的內(nèi)源性βG比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()，然而外源性βG比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()；其他普通細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的患者中HpDNA陽(yáng)性者與陰性者之間的內(nèi)、外源性βG比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。表2HP對(duì)肝內(nèi)膽管結(jié)石組膽汁βG的影響表3HP對(duì)肝內(nèi)膽管結(jié)石組肝組織βG的影響(±s，×103U/mgprot)普通細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性(n＝12)普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性(n＝12)指標(biāo)HpDNA陽(yáng)性(n)HpDNA陰性(n)HpDNA陽(yáng)性(n)HpDNA陰性(n)內(nèi)源性β±(7)±(5)±(7)±(5)外源性β±(7)±(5)±(7)±(5)a：，與普通細(xì)菌培養(yǎng)陰性且HpDNA陰性組比較

3討論

目前研究顯示，Hp是上消化道的主要致病菌，并且Hp在國(guó)人中具有高感染率。而膽管與胃腸道緊密相鄰的解剖關(guān)系，使人們有理由推測(cè)Hp可能進(jìn)入膽管系統(tǒng)致病。我們對(duì)PIS組和對(duì)照組膽汁進(jìn)行Hp培養(yǎng)，結(jié)果均未見(jiàn)Hp菌落，與文獻(xiàn)報(bào)道相同［1-2］。這可能與Hp生長(zhǎng)條件苛刻有關(guān)。同時(shí)本組采用PCR的方法對(duì)PIS組和對(duì)照組的膽汁和膽管黏膜行HpDNA檢測(cè)，結(jié)果顯示PIS患者膽道中存在Hp感染因素，并且具有較高的檢出率，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。說(shuō)明PIS與Hp感染有關(guān)，Hp可能進(jìn)入膽管系統(tǒng)并具有逃避膽汁堿性環(huán)境的自我保護(hù)機(jī)制，成為PIS的原發(fā)性基礎(chǔ)致病菌。既往研究表明，細(xì)菌繁殖產(chǎn)生的外源性βG在膽紅素結(jié)石形成中所起作用已得到公認(rèn)［4］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者［5-6］更提出內(nèi)源性βG的質(zhì)和量與膽紅素結(jié)石形成也有密切關(guān)系。故而我們探究Hp是否像大腸桿菌和厭氧菌一樣產(chǎn)生外源性βG，進(jìn)而導(dǎo)致PIS的形成，同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解Hp與內(nèi)源性βG關(guān)系。我們對(duì)PIS患者膽汁和肝組織中的內(nèi)、外源性βG進(jìn)行檢測(cè)，研究了Hp和βG關(guān)系。由表2和表3可知，在排除了其他普通細(xì)菌干擾后，PIS患者有Hp感染者較無(wú)Hp感染者的外源性βG無(wú)明顯差異，然而內(nèi)源性βG升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。然而在伴有其他普通細(xì)菌感染的PIS患者中HpDNA陽(yáng)性者與陰性者之間的內(nèi)、外源性βG比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義()。其可能由于其他細(xì)菌如大腸桿菌等作為一種混雜因素，對(duì)內(nèi)、外源性βG有影響，掩蓋了Hp感染與βG之間的關(guān)系。以上研究結(jié)果顯示Hp并沒(méi)有通過(guò)產(chǎn)生大量的外源性βG參與PIS的形成，然而伴有Hp感染者其內(nèi)源性βG活性升高，是因?yàn)镠p具有更強(qiáng)的促進(jìn)肝組織釋放內(nèi)源性βG的作用。Hp經(jīng)某種途徑進(jìn)入膽道系統(tǒng)并定植其中，使膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞發(fā)生損傷、變性和壞死，內(nèi)源性βG被大量釋放出來(lái)，導(dǎo)致膽汁中內(nèi)源性βG明顯升高。釋放的內(nèi)源性βG在病灶處使結(jié)合膽紅素分解為游離膽紅素，與鈣等金屬離子結(jié)合，在膽管內(nèi)形成小的肝內(nèi)膽管結(jié)石，并成為PIS核心部分。其導(dǎo)致肝內(nèi)膽管的狹窄，膽汁淤滯，膽流變緩，更易發(fā)生細(xì)菌感染，促進(jìn)結(jié)石的形成、增大和復(fù)發(fā)，造成惡性循環(huán)，導(dǎo)致PIS的形成。

總之，我們認(rèn)為PIS與Hp感染有關(guān)，并且Hp可能通過(guò)內(nèi)源性βG途徑參與PIS的形成，其具體致病機(jī)制有待于更深一步的研究，以便有效的指導(dǎo)臨床對(duì)于PIS的預(yù)防和治療。

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