ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因R219K多態(tài)與冠心病的相關(guān)性研究

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因R219K多態(tài)與冠心病的相關(guān)性研究

作者：王玉明李亞鄭人源潘克儉

【摘要】目的探討ATP-BindingCassetteTransporter1基因R219K多態(tài)在中國漢族人群中的分布及其與冠心病的關(guān)系。方法采用PCR-RFLP方法，對396例CHD患者和417名正常人ABCA1基因R219K多態(tài)位點進(jìn)行分析。結(jié)果對照組R219K多態(tài)K等位基因及KK基因型的頻率較CHD組顯著為高；根據(jù)發(fā)病年齡分組，早發(fā)CHD組K等位基因及KK基因型頻率明顯低于晚發(fā)CHD組和對照組，而在對照組和晚發(fā)CHD組間此頻率差異無顯著性；KK基因型患者血漿甘油三酯水平較RR基因型顯著降低；不同基因型患者血漿高密度脂蛋白膽固醇水平差異無顯著性。結(jié)論ABCA1基因R219K多態(tài)與CHD存在相關(guān)性；KK基因型可能具有對抗動脈粥樣硬化的作用，但這種作用不伴有血漿HDL-C水平的改變。

【關(guān)鍵詞】冠心?。籄BCA1基因；動脈粥樣硬化

Abstract：ObjectiveToinvestigatethedistributionofR219KpolymorphisminATP-BindingCassetteTransporter1geneinChineseHanpopulationandtheassociationofthispolymorphismwithcoronaryheartdisease.MethodsGenotypesweredeterminedbyPCR-RFLPmethodin417unrelatedhealthycontrolsand396CHDThefrequenciesofKalleleandKKgenotypeforcontrolsweresignificantlyhigherthanthoseforpatients.Whenthepatientsweredividedintotwosubgroupsbyonset-age,thefrequenciesofKalleleandKKgenotypeforearly-onsetpatientsweresignificantlylowerthanthose(、)forlate-onsetpatientsandthoseforcontrols,whiletherewerenosuchdifferencesbetweenlate-onsetpatientsandwithRRgenotypehadasignificantlyhigherplasmaconcentrationoftriglycerideswhencomparedwiththatofKKgenotype.Nosignificantdifferencesofplasmahigh-densitylipoproteincholesterollevelwereobservedamongpatientswithdifferentThesedatasuggestthattheR219KpolymorphisminABCA1geneiscorrelatedwithCHD，andtheABCA1geneKKgenotypemayhasafunctionagainstatherosclerosiswithoutdetectablechangeofplasmaHDL-ClevelinChineseHanpopulation.Keywords:coronaryheartdisease；ATP-BindingCassetteTransporter1gene；atherosclerosis

研究表明，血漿中高密度脂蛋白水平與動脈粥樣硬化的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)［1］，HDL對抗AS的功能可能與其在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用有關(guān)［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1基因在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和HDL生成的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵的作用［3、4］。人類ABCA1基因定位于9q22～9q31，編碼一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該蛋白參與調(diào)控脂質(zhì)的細(xì)胞流出過程,并通過與載脂蛋白A-1作用促進(jìn)新生HDL的形成［5］。文獻(xiàn)報道，ABCA1基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)流出減少，血漿中HDL-C嚴(yán)重缺乏，從而使早發(fā)CHD的風(fēng)險顯著增高［3、4］。此外，某些單核苷酸多態(tài)可通過改變ABCA1基因表達(dá)產(chǎn)物的活性或劑量，影響血脂水平或不同基因型個體對CHD的易感性［6］。作者使用PCR-RFLP方法對中國漢族健康人群和CHD患者ABCA1基因R219K多態(tài)位點進(jìn)行了分析，并探討了該多態(tài)與CHD及血脂水平的關(guān)系。

1對象和方法

對象

正常對照組無血緣關(guān)系的四川漢族健康個體417名，其中男248名、女169名，平均年齡(±)歲，經(jīng)詢問病史、體檢、心電圖等檢查排除心血管疾病史。

冠心病患者組四川大學(xué)華西醫(yī)院心血管科住院部冠心病患者396例，其中，男237例、女159例，平均年齡(±)歲。所有病例均經(jīng)冠狀動脈造影證實為CHD，其冠狀動脈至少有一支狹窄度≥50%。

方法

血脂水平的檢測

研究對象均采用禁食12h后取外周血5ml測定血脂水平。TG和TC采用氧化酶法測定，HDL-C、LDL-C以及VLDL-C用PEG變構(gòu)酶法測定。

研究個體DNA的制備

采集病例與對照外周血5ml，1mlACD抗凝劑抗凝。鹽析法抽提DNA后TEbuffer溶解并置于4℃冰箱中備用。

ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)基因組序列，設(shè)計PCR引物，引物序列：正向：5′-AAGTGTCCTGTCATTGTGCC-3′、反向：5′-TCTCCAGTGAGCAAGTCTAC-3′。PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進(jìn)行，擴(kuò)增片段長度為404bp。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積30μl，包括μg基因組DNA，Taq聚合酶1U，MgCl2濃度/L，10×buffer3μl，dNTP各200μmol/L。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物的酶切消化

取10μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入5U限制性內(nèi)切酶XagI，2μL10×酶切buffer,并加超純水至總體積20μl，37℃水浴中保溫16h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-RADGelDoc凝膠分析系統(tǒng)判定基因型。

統(tǒng)計學(xué)處理

計算各組基因型及等位基因頻率，經(jīng)χ2檢驗，確認(rèn)符合Hardy-Weinberg平衡；組間各等位基因頻率和基因型頻率比較采用χ2檢驗；組間不同基因型血脂水平比較用單因素方差分析。數(shù)據(jù)用SPSS12軟件進(jìn)行分析，以P＜為差異有顯著性。

2結(jié)果

CHD組和對照組臨床特點比較

兩組間年齡、性別構(gòu)成比以及血漿中TC、VLDL-C水平差異無顯著性；與對照組比較，CHD組TG、LDL-C水平在升高的同時，HDL-C水平顯著降低。

基因型鑒定

R219K多態(tài)為ABCA1基因第219位密碼子G→A堿基轉(zhuǎn)換，其中，A等位基因存在限制性內(nèi)切酶XagI的切點，從而導(dǎo)致3種基因型的出現(xiàn)：RR型圖1R219K多態(tài)位點的RFLP-PCR電泳結(jié)果

1：KK純合子；2、3：RR純合子；4、5、6：RK雜合子；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(puc19/MspI)

ElectrophoresisresultofPCR-RFLPanalysisofR219Kpolymorphism

Lane1:KKhomozygote:lane2、3：RRhomozygote;Lane4、5、6:RKheterozygote;M:DNAmarker(puc19/MspI)，酶切后長度仍為404bp；KK型，酶切產(chǎn)物為310bp和94bp兩個片段；RK型(GA型、3種片段的雜合子)，酶消化后顯示大小分別為404bp、310bp、94bp的3個片段。

CHD組與對照組間基因型和等位基因頻率的比較R219K多態(tài)各基因型在兩組中分布符合遺傳Hardy-Weinberg平衡。經(jīng)χ2檢驗，等位基因R、K頻率在兩組間分布差異有顯著性，對照組K等位基因頻率顯著高于CHD組；對照組KK基因型頻率顯著高于CHD組；CHD與K等位基因負(fù)關(guān)聯(lián)［OR=，95%CI(,)］；與基因型KK負(fù)關(guān)聯(lián)［OR=，95%CI］。

CHD分組后基因型和基因頻率分布比較表1ABCA1基因R219K的基因型及等位基因頻率在對照組和CHD組中的分布照組比較，P＜）；OR：oddsratio。

參照有關(guān)CHD發(fā)病年齡分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，將CHD組分為早發(fā)CHD組和晚發(fā)CHD組，并對兩個亞組基因及基因型頻率分布進(jìn)行分析。早發(fā)CHD組K等位基因及KK基因型頻率在明顯低于對照組的同時。表2R219K基因型和等位基因在早發(fā)CHD組和晚發(fā)CHD組中的頻率分布CHD組比較，△P＜）。

不同基因型患者間血脂水平的比較

方差分析結(jié)果表明，RR基因型的患者血漿TG水平在明顯高于KK基因型患者的同時，也有高于RK基因型患者的傾向。表3不同基因型患者血脂水平比較*P＜;血脂指標(biāo)濃度單位均為mmol/L(unitsofplasmalipidlevelsaredenotedbymmol/L)

3討論

R219K多態(tài)為ABCA1基因第219密碼子G→A轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致Arg→Lys氨基酸替代。我們首次報道K等位基因頻率在中國漢族群體為，較德國人頻率、芬蘭人［6］顯著增高。另外，Yamakawa［6］等在327名中學(xué)生群體篩查的結(jié)論支持K等位基因在日本人群中可能為野生型，高于上述報道的頻率。說明R219K多態(tài)的變異頻率在不同的種族間存在差異性。

Clee［8］等在對荷蘭CHD患者的研究中發(fā)現(xiàn)，K等位基因能減少冠狀動脈再狹窄、心肌梗塞、死亡等并發(fā)癥的發(fā)生率，并能減緩AS的進(jìn)程，提出K等位基因?qū)τ跍p少冠心病的發(fā)生具有保護(hù)作用。我們采用病例—對照研究，分析了中國漢族健康人群和CHD患者R219K多態(tài)性。結(jié)果顯示，對照組K等位基因及KK基因型頻率均顯著高于CHD組。表明該多態(tài)可能與中國人CHD存在相關(guān)性，并提示純合狀態(tài)下的K等位基因可能是拮抗AS的保護(hù)因子，與Clee等報道略有不同。

在此基礎(chǔ)上，作者根據(jù)CHD患者發(fā)病年齡進(jìn)行分組，結(jié)果可見早發(fā)CHD組K等位基因和KK基因型頻率均較晚發(fā)CHD組降低，而上述基因和基因型頻率在對照組和晚發(fā)CHD組間差異無顯著性，提示KK基因型和CHD發(fā)病年齡相關(guān)，對于CHD的發(fā)生，KK基因型年輕個體較RR、RK基因型年輕個體可能具有更低的易感性，更易于晚發(fā)CHD。因而也從另一角度提示KK基因型可能對減少冠心病的發(fā)生具有保護(hù)作用。

值得注意的是，未見不同基因型患者間血漿HDL-C水平有顯著差異。Zwarts［9］等在對該基因其它多態(tài)研究中也得出類似結(jié)論，并認(rèn)為K等位基因?qū)笰S的作用并非表現(xiàn)為血漿HDL-C濃度升高。轉(zhuǎn)基因動物模型研究［10］發(fā)現(xiàn)，ABCA1基因的過度表達(dá)，導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的增加，但血漿中HDL-C濃度變化甚微。提示，RCT速度的加快，可能

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