三代測序技術的比較

一代、二代、三代測序技術張祥瑞2013/04/2211:43第一代測序技術-Sanger鏈終止法一代測序技術是20世紀70年代中期由FredSanger及其同事首先發(fā)明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈 DNA分子區(qū)分開來。一代測序實驗的起始材料是均一的單 鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止 試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進行 分離的方法。測序引物與單鏈DNA莫板分子結合后，DNAR合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行，每一組分別用四種ddNTP（雙脫氧核苷酸）中的一種來進行終止，再用PAG吩析四組樣品。從得到的PAGE交上可以讀出我們需要的序列。第二代測序技術-大規(guī)模平行測序大規(guī)模平行測序平臺（massivelyparallelDNAsequencingplatform）的出現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權”能夠被眾多研究人員分享。新一 代DNA測序技術有助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品， 例如美國RocheAppliedScienee公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理， 從而獲得待測DNA勺序列信息。以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程，（1）文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸黏性末端。然后將川umina測序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的 DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構， 以供后續(xù)的預擴增使用。通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。（ 3）測序，分三步：DNA聚合酶結合熒光可逆終止子，熒光標記簇成像，在下一個循環(huán)開始前將結合的核苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析第三代測序技術-高通量、單分子測序被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀，PacificBioscienee 的SMR■技術和OxfordNanoporeTechnologies 公司正在研究的納米孔單分子測序技術正向著高通量低成本長讀取長度的方向發(fā)展。不同于第二代測序依賴于DNA模板與固體表面相結合然后邊合成邊測序，第三代分子測序，不需要進行PCRT增。（1）HelicoBioScience單分子測序技術。該測序是基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉移酶在 3'末端加上poly（A）,以及在poly（A）的末端進行熒光標記和阻斷，把這些小片段與帶有 poly（T）的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶和被Cy3熒光標記脫氧核苷酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上是否有熒光信號，然后化學裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應。（2）PacificBioscienceSMRTT技術。該測序也是基于邊合成邊測序的原理，這項技于使用了Zero-ModeWaveguide（ZMW）零級波導）。測序的過程：被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標記），被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結束后，被標記的磷酸集團被切割并釋 放，聚合酶轉移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環(huán)。（3）OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測序技術。大多數(shù)納米孔測序技術的基本原理是當 DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經(jīng)過時而檢測到被影響的電流或光信號。 OxfordNanopore測序技術是以a-溶血素來構建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側的外表面，一種合成的環(huán)糊精做為傳感器共價結合到納米孔的內(nèi)表面。這個系統(tǒng)被鑲嵌在一個脂雙分子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子層兩側為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA單個堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用， 影響了流過納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留 是時間是其他核苷酸的2-3倍，所以每個堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。不同代測序方法的原理、發(fā)展和應用摘要：目前為止，已經(jīng)發(fā)展出了三代不同的測序技術。第一代測序技術具有較長的測序片段和高準確率，在人類基因組計劃中發(fā)揮了極大的作用。第二代測序技術實現(xiàn)了高通量、高效率、高準確度，大大降低了測序成本。第三代測序技術即納米孔單分子測序技術，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，應用潛能也勢必超越先前的測序技術。關鍵詞：測序技術，高通量目前為止，已經(jīng)發(fā)展出了三代不同的測序技術，這些測序技術具有不同的原理和特點，因此其適用范圍也不同。1、 第一代測序技術1975年Sanger和Coulson發(fā)明了“PlusandMinus”（俗稱“加減法”）測定DNA序列；1977年MaxamandGilbert發(fā)明了化學降解法測序；1977年Sanger引入ddNTP（雙脫氧核苷三磷酸），發(fā)明了著名的雙脫氧鏈終止法。雙脫氧鏈終止法有效控制了化學降解法中化學毒素和同位素的危害， 在隨后的二十多年得到很好的應用。這些技術及在此基礎上發(fā)展的相關技術統(tǒng)稱為第一代測序技術。第一代測序技術憑借其長的序列片段和高的準確率，適合對新物種進行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補，尤其在人類基因組計劃中發(fā)揮了極大的作用和進行了發(fā)展。但第一代測序技術成本昂貴，而且難以勝任微量DNA羊品及大規(guī)模高通量測序工作的要求。2、 第二代測序技術隨著人類基因組計劃的完成，人們開始進入后基因組時代?？茖W家逐漸測出多種生物的序列，傳統(tǒng)的測序技術已無法滿足高通量和高效率的大規(guī)?；蚪M測序,第二代DNA測序技術就誕生了。第二代測序技術實現(xiàn)了高通量、高效率、高準確度，大大降低了測序的成本，DNA測序可以向個人測序發(fā)展。第二代測序技術中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結構，但是在判斷連續(xù)單堿基重復區(qū)時準確度不高。 Solexa較454具有通量高、片段短、價位低的特點，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序（paired-endsequencing）可以為基因組進一步拼接提供定位信息，但是隨著反應輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀 AT區(qū)時有明顯錯誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯能力以及較高的測序通量，適合轉錄本研究以及比較基因組學特別是 SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術在基因組拼接中的廣泛應用。3、 第三代測序技術隨著在遺傳學研究中，成千上萬的基因組需要測出及