CCL20在胸腺CD4-CD25-T細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及其意義

CCL20在胸腺CD4+CD25+T細(xì)胞發(fā)育過程中的作用及其意義

作者：邵先安,熊思東,張瑞華,袁福華,王勇,陳芝河,徐長江

【摘要】目的:研究趨化因子CCL20對小鼠胸腺CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞發(fā)育的影響,為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞調(diào)控的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法:采用d齡胚鼠胸腺進(jìn)行體外培養(yǎng),以流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)間點(diǎn)胸腺CD4+CD25+細(xì)胞的變化,同時(shí)計(jì)數(shù)每個(gè)胸腺小葉的細(xì)胞數(shù)變化。結(jié)果:體外胸腺培養(yǎng)的第1～6天胸腺細(xì)胞比例,細(xì)胞數(shù)量趨勢變化與胸腺體內(nèi)發(fā)育的第、15、16、17、18、19天CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞的比例,細(xì)胞數(shù)量的趨勢變化相似;在胸腺體外培養(yǎng)的第1～6天,CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例分別為%、%、%、%、%、%,占CD25+T細(xì)胞的比例分別為%、%、%、%、%、%,這一發(fā)育趨勢與體內(nèi)結(jié)果具有一致性。在4mg/L的CCL20干預(yù)下,胸腺體外培養(yǎng)的第3、6天CD4+CD25+胸腺細(xì)胞分別從±、±下降至±、±。結(jié)論:體外培養(yǎng)的CD4+CD25+雙陽性胸腺細(xì)胞數(shù)量和比例變化與體內(nèi)發(fā)育變化趨勢一致,CCL20明顯下調(diào)胸腺CD4+CD25+的表達(dá),這將為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)控研究提供有效的參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】胸腺細(xì)胞CD4+CD25+CCL20體外胸腺器官培養(yǎng)

Sakaguchi等[1]研究發(fā)現(xiàn),給小鼠輸入CD4+CD25+T細(xì)胞,會下調(diào)免疫應(yīng)答,研究者們進(jìn)一步在動(dòng)物模型和臨床病例證實(shí)該細(xì)胞參與自身免疫病的發(fā)生、腫瘤的免疫逃避以及移植物抗宿主反應(yīng)。隨后的研究證實(shí)了該群細(xì)胞為CD4+CD25+foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,小鼠體內(nèi)輸注經(jīng)同種抗原活化的CD4+CD25+T細(xì)胞,可引起特異性免疫耐受,不僅如此,它在免疫系統(tǒng)發(fā)育、自身免疫、腫瘤逃逸等過程中均扮演重要的角色,成為當(dāng)前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,其中天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對機(jī)體具有舉足輕重作用。目前就其來源、亞群、特點(diǎn)、轉(zhuǎn)歸及其在T細(xì)胞活化中的作用研究都有了長足的進(jìn)展,但對這群細(xì)胞在胸腺發(fā)育中的變化及調(diào)控因素尚不清楚。而CCL20是CC亞家族的趨化因子,該趨化因子的受體分布于未成熟的樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞上[4-6],在固有免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用。人們對CCL20的研究顯示該趨化因子在胸腺中表達(dá)明顯,其受體CCR6是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志之一,但其在胸腺中存在的意義以及其是否參與胸腺CD4+CD25+T細(xì)胞的發(fā)育尚不清楚,因此本研究擬采用不同孕齡的胎鼠,以體外胸腺器官培養(yǎng)技術(shù)在體外以CCL20對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),對CD4+CD25+T細(xì)胞的體內(nèi)外發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行比較研究,以期為該群細(xì)胞發(fā)育和調(diào)控的深入研究提供了依據(jù)。

1材料和方法

材料8周齡左右成熟雌性和雄性BALB/c小鼠(H2d),雌鼠120只,雄鼠20只,由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。不同日期的孕鼠由本實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)交配完成。細(xì)胞培養(yǎng)試劑RPMI1640、L谷氨酰胺;雙抗;小牛血清/NBS;胎牛血清;FITC標(biāo)記兔抗小鼠CD4單克隆抗體;PE標(biāo)記山羊抗小鼠CD25mAb。顯微外科鑷、剪;μm微孔濾膜;D6450HanaoCO2培養(yǎng)箱;FACSCalibur流式細(xì)胞儀。趨化因子CCL20。

方法

孕鼠交配與鑒定按照我們已建立的孕齡測定方法和體外培養(yǎng)系統(tǒng),取成熟雌性小鼠2～3只和雄性小鼠1只于前1d晚9∶00左右合籠,次日晨8∶00左右取出雌性小鼠,以見到陰栓形成為確認(rèn)懷孕日期,并計(jì)算為0d,將其單獨(dú)飼養(yǎng)并標(biāo)記,在d時(shí)再次觀察腹部確認(rèn)懷孕,解剖孕鼠,摘取胚鼠胸腺小葉用于實(shí)驗(yàn)[10]。

胚鼠胸腺器官的培養(yǎng)醫(yī)用明膠海綿切成1cm2左右的方塊,放入24孔板中,加入1mLRPMI1640培養(yǎng)液。滅菌濾膜充分濕潤后覆蓋在明膠海綿上,吸棄mL培養(yǎng)液,使24孔板中最終剩mL培養(yǎng)液。頸椎脫位處死孕鼠,從孕鼠子宮中取出胚鼠,置于加有PBS的100mm的平皿中,根據(jù)大小等特征再次判斷其胚齡。剪開胚鼠胸腔,取出胸腺小葉經(jīng)PBS充分清洗,每孔加8個(gè)胸腺小葉,每組均為雙復(fù)孔進(jìn)行培養(yǎng)。CCL20干預(yù)組在培養(yǎng)的第0、3天加趨化因子CCL20。體內(nèi)胸腺細(xì)胞發(fā)育過程的研究分別取不同孕齡的母鼠,依照以上步驟取出胸腺小葉后,制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)、染色[10]。

流式細(xì)胞術(shù)檢測制備胚鼠胸腺單細(xì)胞懸液。毛玻片碾碎,PBS洗3次,棄上清,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為×109/L,加入1μLFITC標(biāo)記CD4和PE標(biāo)記CD25mAb,輕輕混勻,4℃,避光,靜置30min。PBS洗3次后,用500μLPBS重懸,流式細(xì)胞術(shù)檢測。檢測體外培養(yǎng)胸腺時(shí),將胸腺小葉從濾膜上取出,依照以上方法制成懸液并染色,BDcaliber機(jī)型檢測,Cellquest軟件分析[10]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)用軟件處理。

2結(jié)果

體外及體內(nèi)胸腺細(xì)胞總數(shù)的變化系統(tǒng)反映存在于胸腺細(xì)胞中的CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞的體內(nèi)外發(fā)育狀況,首先觀察了整個(gè)胸腺細(xì)胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示:d胚齡鼠的胸腺細(xì)胞為雙陰性時(shí)期或者稍有陽性,是進(jìn)行胸腺細(xì)胞發(fā)育研究的最佳起始時(shí)間[10]。體內(nèi)發(fā)育過程中,胎鼠胸腺小葉隨發(fā)育時(shí)間增加逐漸增大,胸腺細(xì)胞總數(shù)隨母鼠育齡的增加持續(xù)增多,從第天的×104/每葉胸腺增加至第15天時(shí)的×104/每葉胸腺,出生前每葉胸腺的細(xì)胞數(shù)量上升至×106,出生24h內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)每葉胸腺的細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增至×106。與體內(nèi)胸腺細(xì)胞發(fā)育規(guī)律類似,體外培養(yǎng)顯示:在6d時(shí)間內(nèi),胸腺細(xì)胞表型由CD4-CD8-雙陰性向CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞發(fā)育。體外培養(yǎng)時(shí)肉眼可見胸腺小葉比培養(yǎng)起始時(shí)有形態(tài)的增大,細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示每個(gè)胸腺小葉細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增多。培養(yǎng)第1天時(shí)每個(gè)胸腺小葉的細(xì)胞數(shù)量比剛?cè)〕鰰r(shí)略有下降,從第0天的×104下降為×104,第2天開始上升,到第6天時(shí)每個(gè)胸腺小葉細(xì)胞數(shù)量增長到×106。

圖1胚鼠胸腺細(xì)胞數(shù)目的體內(nèi)外動(dòng)態(tài)變化

CD4+CD25+雙陽性胸腺細(xì)胞的體內(nèi)外發(fā)育進(jìn)一步研究CD4+CD25+雙陽性胸腺細(xì)胞的體內(nèi)外發(fā)育狀況顯示:在體內(nèi)情況下,d胚鼠的胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+占全部胸腺細(xì)胞的比例為%,17d增至峰值%,而后降低至19d的%。CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)在d為×104/胸腺小葉,17d增加至×105/胸腺小葉,而后增至19d的×104/胸腺小葉。CD4+CD25+占CD4+細(xì)胞的比例在d為%,16d增至峰值%,而后持續(xù)降低至19d的%。CD4+CD25+占CD25+細(xì)胞的在d比例為%,后隨發(fā)育時(shí)間的增加而持續(xù)增至%。體外培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞與體內(nèi)胸腺細(xì)胞發(fā)育規(guī)律類似:體外培養(yǎng)1d時(shí),胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+的比例體內(nèi)為%,4d增至峰值%,而后降低至6d的%。CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)在1d為×104,4d增加至×104,持續(xù)增至6d的×104。CD4+CD25+占CD25+細(xì)胞的在1d比例為%,持續(xù)增加至%。僅CD4+CD25+占CD4+細(xì)胞的比例與體內(nèi)不同,在1d為%,而后持續(xù)降低至6d的%。

圖2胚鼠胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+細(xì)胞的體內(nèi)外動(dòng)態(tài)變化

A:CD4+CD25+胸腺細(xì)胞百分比;B:CD4+CD25+胸腺細(xì)胞數(shù);C:CD4+CD25+/CD4+百分比;D:CD4+CD25+/CD25+百分比.

CCL20干預(yù)胸腺CD4+CD25+細(xì)胞的發(fā)育由于CCL20表達(dá)于胸腺中,為了研究CCL20是否對胸腺CD4+CD25+細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生影響,以一定濃度的CCL20與胸腺細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果顯示在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的影響,在培養(yǎng)的第3、6天,CD4+CD25+胸腺細(xì)胞的比例明顯降低,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明CCL20濃度的增加,CD4+CD25+胸腺細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)其所占胸腺細(xì)胞的比例呈劑量依賴關(guān)系,提示CCL20在胸腺CD4+CD25+細(xì)胞的發(fā)育過程中扮演著重要作用。

圖3CCL20抑制胸腺細(xì)胞的發(fā)育呈劑量依賴性

表1CCL20干預(yù)胸腺CD4+CD25+細(xì)胞的發(fā)育

3討論

國內(nèi)有文獻(xiàn)顯示胎兒胸腺細(xì)胞懸液可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),提示胸腺中存在具有抑制功能的一群細(xì)胞。由于其具有的獨(dú)特作用方式和功能特征,天然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg細(xì)胞受到廣泛關(guān)注,該細(xì)胞表面表達(dá)非專一的CD25/CD62L/CD103/CTLA4/GIT/FoxP3等分子標(biāo)記[11]。

外源性分子對胸腺細(xì)胞的數(shù)量和表型可能產(chǎn)生一定程度的影響[12],胸腺髓質(zhì)樹突狀細(xì)胞對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育分化有作用,共刺激分子和細(xì)胞因子也參與了胸腺CD4+CD25+Treg的產(chǎn)生[13],為了研究趨化因子CCL20是否對胸腺細(xì)胞中的CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞的發(fā)育有調(diào)控作用,首先觀察了總的胸腺細(xì)胞的數(shù)量情況和CD4+CD25+雙陽性胸腺細(xì)胞體內(nèi)外發(fā)育狀況,該群細(xì)胞在體內(nèi)外的數(shù)量和比例變化表現(xiàn)具有一致性。

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步比較了CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞的體內(nèi)外發(fā)育狀況。隨著胚鼠在母鼠體內(nèi)的發(fā)育,胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+的比例逐漸增加,到第17天時(shí)比例達(dá)最高,為%;由于胸腺細(xì)胞總數(shù)隨發(fā)育不斷增加,因此CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)量在第18天時(shí)最多,為×105,而此時(shí)胸腺細(xì)胞中其比例下降為%。與體內(nèi)胸腺細(xì)胞發(fā)育規(guī)律類似,體外結(jié)果顯示:隨培養(yǎng)時(shí)間的增加,胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+的比例和數(shù)量逐漸增加,到第4天時(shí)胸腺細(xì)胞中CD4+CD25+的比例為%,達(dá)最高,細(xì)胞數(shù)為×104,CD4+CD25+占CD4+細(xì)胞的%,約占CD25+細(xì)胞的一半;到培養(yǎng)的第6天,CD4+CD25+的比例下降,但細(xì)胞總數(shù)達(dá)最高,為×104,占CD25+細(xì)胞的%。同時(shí),結(jié)果顯示CD4+CD25+占CD4+細(xì)胞的比例體內(nèi)、外表現(xiàn)出不同步性,可能是因?yàn)镃D4+CD25+這群細(xì)胞的來源具有異質(zhì)性的原因。另外的研究也顯示CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞實(shí)際上來源于2個(gè)群體:首先在胸腺發(fā)育早期,胸腺細(xì)胞表現(xiàn)為CD4-CD8-雙陰性,此時(shí)有%的胸腺細(xì)胞為CD25+,CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞可能來自于早期的雙陰性T細(xì)胞,即先出現(xiàn)CD25表型而后出現(xiàn)CD4表型。隨著發(fā)育的成熟,CD4+T細(xì)胞增多,CD25+胸腺細(xì)胞減少,另一部分CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞可能是先有CD4表型,而后出現(xiàn)CD25表型,經(jīng)歷一個(gè)CD25+到CD25-再到CD25+的轉(zhuǎn)變過程,最終發(fā)育成CD4+CD25+雙陽性T細(xì)胞,該2群CD4+CD25+是否都發(fā)育成具有抑制功能的Treg細(xì)胞有待于進(jìn)一步的研究。在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察了CCL20對CD4+CD25+胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響,結(jié)果顯示CCL20下調(diào)CD4+CD25+的表達(dá),且與CCL20的濃度存在劑量依賴關(guān)系,有文獻(xiàn)報(bào)道IL10可以誘導(dǎo)CCR6的表達(dá)[14],CCL20下調(diào)這群細(xì)胞的表達(dá)是否和他受體的表達(dá)有關(guān)有待于進(jìn)一步的研究,這些數(shù)據(jù)可能為胸腺CD4+CD25+發(fā)育和調(diào)控的研究提供一個(gè)新的依據(jù)。

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