細(xì)胞凋亡及機(jī)制檢測(cè)

細(xì)胞(xìbāo)凋亡（科普詩）

apoptosis似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向(zǒuxiàng)生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;第一頁，共七十二頁。精選ppt危難中的細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見了快樂美好的時(shí)光；這一切的一切又融入臨近(línjìn)的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。

第二頁，共七十二頁。精選ppt第三頁，共七十二頁。精選ppt第四頁，共七十二頁。精選ppt

典型的凋亡小體（apoposisboby）：由透亮空泡和不透光的濃密(nóngmì)的核碎片兩部分組成。第五頁，共七十二頁。精選ppt第六頁，共七十二頁。精選ppt第七頁，共七十二頁。精選ppt

壞死凋亡1.性質(zhì)病理性,非特異性生理性或病理性，特異性2.誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈病理性刺激,隨機(jī)發(fā)生生理性或較弱病理性刺激，非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)被動(dòng)過程,無新蛋白合成,不耗能耗能的主動(dòng)過程，有新蛋白合成4.形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞皺縮，核固縮,膜可發(fā)泡成芽,形成凋亡小體5.DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-120bp）,電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無有8.基因調(diào)控?zé)o有細(xì)胞凋亡與壞死(huàisǐ)的比較第八頁，共七十二頁。精選ppt2002年10月7日英國(guó)人悉尼·布雷諾爾、美國(guó)人羅伯特·霍維茨和英國(guó)人約翰·蘇爾斯頓，因在細(xì)胞(xìbāo)程序性死亡方面的研究獲諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston

第九頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)生(fāshēng)機(jī)制的

新認(rèn)識(shí)1.該“死”的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞）未死，是造成腫瘤、自身免疫性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一?！?xì)胞凋亡不足2.不該(bùɡāi)“死”的細(xì)胞（如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞）死了，這與老年性癡呆、心肌缺血/再灌注損傷等發(fā)病有關(guān)?！?xì)胞凋亡過度第十頁，共七十二頁。精選ppt胸腺細(xì)胞(xìbāo)正常(zhèngcháng)凋亡(diāowánɡ)第十一頁，共七十二頁。精選ppt胸腺細(xì)胞(xìbāo)正常(zhèngcháng)凋亡(diāowánɡ)第十二頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的過程1.凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.凋亡基因(jīyīn)激活3.細(xì)胞凋亡的執(zhí)行4.凋亡細(xì)胞的清除第十三頁，共七十二頁。精選ppt凋亡(diāowánɡ)過程及分期

誘導(dǎo)期執(zhí)行期消亡期

凋亡誘導(dǎo)因素受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺死亡信號(hào)凋亡相關(guān)基因激活Dnase激活(jīhuó)Capases激活巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)細(xì)胞第十四頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的生化改變1.DNA的片段化“梯”狀條帶2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用(zuòyòng)3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用第十五頁，共七十二頁。精選ppt1.DNA的片段化“梯”狀條帶為細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)主要特征①幾乎所有凋亡細(xì)胞均有核小體間的裂解，導(dǎo)致DNA的斷裂；②DNA降解過程的特異性：不伴有組蛋白和其它(qítā)核蛋白的降解；③染色質(zhì)在核小體間的裂解是凋亡細(xì)胞和形態(tài)改變的基礎(chǔ)；④DNAfragmentation是凋亡的“goldenmarker”。第十六頁，共七十二頁。精選ppt第十七頁，共七十二頁。精選ppt2.內(nèi)源性核酸(hésuān)內(nèi)切酶激活及其作用由一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)激活(jīhuó)，執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割第十八頁，共七十二頁。精選ppt3.

Caspase9激活，需要通過CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、細(xì)胞色素c、ATP等多個(gè)因子的參與

Caspases在凋亡(diāowánɡ)中的主要作用1.滅活細(xì)胞(xìbāo)凋亡的抑制物（如Bcl-2）；2.水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體（apoposisboby）；3.在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能第十九頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的調(diào)控（一）細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)相關(guān)因素1.誘導(dǎo)性因素2.抑制性因素

(二)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)第二十頁，共七十二頁。精選ppt1.細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的誘導(dǎo)因素.生理活性因子：TNF家族(Fas-L,TNF)、TGF、神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、多巴胺)、生長(zhǎng)因子撤退、GC等.損傷相關(guān)因子：熱休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射線等.化療藥物(yàowù).毒素：乙醇、β-淀粉樣肽第二十一頁，共七十二頁。精選ppt2.細(xì)胞凋亡的抑制(yìzhì)因素.凋亡(diāowánɡ)相關(guān)基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制劑：生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、鋅、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、桿狀病毒p35、棒狀病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBVBHRF1等.藥物：Calpain抑制劑、caspases抑制劑、促癌劑、佛波豆蔻乙脂(PMA)等第二十二頁，共七十二頁。精選ppt(二)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)

凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(xìtǒng)特點(diǎn)①多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同②偶聯(lián)性：與增殖(zēngzhí)分化的信號(hào)系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第二十三頁，共七十二頁。精選ppt㈡細(xì)胞(xìbāo)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)(yòudǎo)信號(hào)cellR神經(jīng)酰胺多途徑(tújìng)RSAPK/JNKP53基因NF-kB,JNK/AP-1途徑激活baxor下調(diào)bcl-2ROSmtDNA第二十四頁，共七十二頁。精選ppt㈢細(xì)胞(xìbāo)凋亡相關(guān)基因抑制凋亡基因(jīyīn)：bcl-2促進(jìn)凋亡基因：fas，P53雙向調(diào)控基因：c-myc，bclx研究較多的有c-myc、bcl-2、p53、Ice、Fas/APO-1等。第二十五頁，共七十二頁。精選ppt1.c-mycc-myc誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)生長(zhǎng)因子存在(cúnzài)，bcl-2基因表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。第二十六頁，共七十二頁。精選ppt第一個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因，存在于線粒體外膜、核膜及部分(bùfen)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。bcl-2相當(dāng)于線蟲的ced9。Bcl-2家族可分為兩類，一類是抗凋亡的，如：Bcl-2；一類是促進(jìn)凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚體形體發(fā)揮作用。2.bcl-2第二十七頁，共七十二頁。精選pptBcl-2抗凋亡(diāowánɡ)機(jī)制①直接(zhíjiē)的抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)③抑制促凋亡的Bax，Bak細(xì)胞毒作用④抑制Caspases激活⑤維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)第二十八頁，共七十二頁。精選ppt3.fasfas又稱作APO-1或CD95，屬TNF受體和NGF受體家族。對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用基因產(chǎn)物(chǎnwù)為45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。第二十九頁，共七十二頁。精選ppt與線蟲ced-3同源，又稱為Caspase。ICE是一種半胱氨酸蛋白酶，在人類，ICE家族至少有11個(gè)成員，每一成員均含有(hányǒu)與底物結(jié)合及催化的保守序列，識(shí)別位點(diǎn)在Asp之后，故又稱Caspases。

啟動(dòng)子Caspases：Caspases8、9和10效應(yīng)子Caspases：Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族(jiāzú)第三十頁，共七十二頁。精選ppt5.Apaf-1與線蟲的ced-4同源；在線粒體參與的凋亡途徑中發(fā)揮作用；能激活Caspase3，這一過程(guòchéng)需要細(xì)胞色素c和Caspase9的參與。第三十一頁，共七十二頁。精選ppt6.p53

磷酸化p53使細(xì)胞處于G1期，必要時(shí)誘導(dǎo)(yòudǎo)細(xì)胞凋亡。p21CDKRB不被磷酸化G1DNA損傷p53并磷酸化Bax,BclapoptosisGadd45DNA修復(fù)野生型P53基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞(xìbāo)凋亡的功能——“分子警察”；第三十二頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡發(fā)生機(jī)制（一）氧化損傷(sǔnshāng)（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡(三)線粒體損傷第三十三頁，共七十二頁。精選ppt（一）氧化損傷(sǔnshāng)機(jī)制氧自由基可破壞機(jī)體正常的氧化/還原的動(dòng)態(tài)平衡，造成生物大分子的氧化損傷，干擾正常的生命活動(dòng)，形成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)——后果：誘導(dǎo)(yòudǎo)細(xì)胞凋亡。第三十四頁，共七十二頁。精選ppt氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的可能(kěnéng)機(jī)制1.氧自由基引起的DNA損傷可激活P53基因引起細(xì)胞凋亡。2.氧自由基引起的DNA損傷可活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗，引發(fā)細(xì)胞凋亡。3.氧自由在攻擊(gōngjī)細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，通過脂質(zhì)過氧化作用直接造成細(xì)胞膜的損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化產(chǎn)物過氧羥基24碳四烯酸有很強(qiáng)的誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用。第三十五頁，共七十二頁。精選ppt氧化應(yīng)激引起(yǐnqǐ)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制（續(xù)）4.氧化應(yīng)激可激活Ca2+/Mg2+依賴的DNase，也可產(chǎn)生膜的發(fā)泡現(xiàn)象。5.氧化應(yīng)激引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，可改變細(xì)胞膜的通透性使Ca2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。自由基對(duì)線粒體膜的損害導(dǎo)致其通透性和膜電位的變化也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1，可加速(jiāsù)細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。第三十六頁，共七十二頁。精選ppt（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)胞凋亡的可能(kěnéng)機(jī)制1.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶(DNase)，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的酰基轉(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲?，暴露出核小體之間的連接(liánjiē)區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA。第三十七頁，共七十二頁。精選ppt(三)線粒體損傷(sǔnshāng)第三十八頁，共七十二頁。精選ppt第三十九頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞凋亡的惡性網(wǎng)絡(luò)(wǎngluò)假說線粒體Δ

Ψm↓PTP開放(kāifàng)Apaf+Cyt.C

AIFCaspase抑制劑+Caspase9酶原(méiyuán)Caspase-9Caspase3酶原Caspase-3蛋白質(zhì)水解無活性核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶激活DNA斷裂++–+–Bcl-2––Ca2+apoptosis？第四十頁，共七十二頁。精選ppt氧化(yǎnghuà)損傷鈣穩(wěn)態(tài)失衡(shīhénɡ)線粒體損傷(sǔnshāng)惡性網(wǎng)絡(luò)假說(deleteriousnetworkhypothesis)

細(xì)胞凋亡Δ

Ψm↓

AIF，ApafPTPopen第四十一頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的生物學(xué)意義1.發(fā)育從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物的發(fā)育，都存在著程序性細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。2.免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成熟過程中，始終(shǐzhōng)伴隨著細(xì)胞凋亡。3.衰老細(xì)胞凋亡與許多年齡相關(guān)疾病有直接或間接的聯(lián)系。4.損傷與修復(fù)5.腫瘤發(fā)生細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)。6.病毒致病病毒表達(dá)抗凋亡蛋白。第四十二頁，共七十二頁。精選pptHutchinson-Gilfordsyndrome

第四十三頁，共七十二頁。精選ppt第四十四頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡與疾?。ㄒ唬┘?xì)胞(xìbāo)凋亡不足1.腫瘤2.自身免疫病第四十五頁，共七十二頁。精選ppt1.凋亡與惡性腫瘤

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，還與凋亡障礙(zhàngài)有關(guān)。Oncogenes“anti-apoptic”genesCelldivisioncelldeath腫瘤治療新思路：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡第四十六頁，共七十二頁。精選ppt2.凋亡(diāowánɡ)與免疫系統(tǒng)功能障礙凋亡對(duì)免疫系統(tǒng)功能有重要調(diào)節(jié)作用淋巴細(xì)胞：在發(fā)育過程中有凋亡發(fā)生；在晚期，當(dāng)與抗原相互作用時(shí)亦發(fā)生凋亡。胸腺發(fā)育過程中的自然凋亡過程第四十七頁，共七十二頁。精選ppt（二）細(xì)胞(xìbāo)凋亡過度1.心血管疾?。?）心肌缺血與缺血-再灌注(guànzhù)損傷（2）心力衰竭第四十八頁，共七十二頁。精選ppt（1）心肌缺血和再灌注損傷

心肌缺血再灌注后可引起心肌細(xì)胞的凋亡，由于心肌組織中吞噬細(xì)胞(tūnshìxìbāo)數(shù)量有限，故而凋亡細(xì)胞可以激發(fā)性引起炎性反應(yīng)，招引中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織壞死（心肌梗塞）。第四十九頁，共七十二頁。精選ppt(2)凋亡與心臟病

心臟傳導(dǎo)障礙和心律失常心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)在胚胎早期就已形成。新生兒竇房結(jié)主要有大量起搏細(xì)胞(xìbāo)（P細(xì)胞(xìbāo)）和少量膠原組成，而成人則為少量P細(xì)胞(xìbāo)和大量膠原構(gòu)成，可能是P細(xì)胞(xìbāo)凋亡的結(jié)果。因此P細(xì)胞(xìbāo)凋亡不足或過度均可引起心律失常。第五十頁，共七十二頁。精選ppt2.神經(jīng)元退性疾?。?）阿爾茨海默病(AD)（2）帕金森?。?）多發(fā)性硬化癥第五十一頁，共七十二頁。精選ppt(1)凋亡與神經(jīng)退行性病變

神經(jīng)元是non-proliferating,long-lived,terminallydifferentiatedcell。神經(jīng)元等非增殖細(xì)胞發(fā)生凋亡的意義：1、避免細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，特別(tèbié)是遇到致轉(zhuǎn)化刺激信號(hào)時(shí)。如向終末分化的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染oncogene可引起細(xì)胞凋亡，而非增殖。第五十二頁，共七十二頁。精選ppt(2)為了器官(qìguān)生存的需要Adeletedcellismoreadvantageousthanadamagedcell,evenwhenthecellisirreplaceable.Thisisanalogoustowhatisfrequentlyreferredtoas“betterdeadthanwrong”fordividingcell第五十三頁，共七十二頁。精選ppt3.病毒感染人免疫(miǎnyì)缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS第五十四頁，共七十二頁。精選ppt(凋亡與免疫缺陷性疾病)典型例子是AIDS1.HIV-1感染后可引起CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡，且可能由病毒被膜蛋白復(fù)合體gp120介導(dǎo)。2.AIDS患者外周血淋巴細(xì)胞Fas/Apo水平明顯提高，可迅速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

由此，通過控制凋亡過程(guòchéng)是否可以預(yù)防或延緩AIDS的進(jìn)展。第五十五頁，共七十二頁。精選ppt（三）細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)不足與

過度并存動(dòng)脈粥樣硬化(yìnghuà)即屬于這種情況，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞而言是凋亡過度，對(duì)平滑肌細(xì)胞來說則是凋亡不足第五十六頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)在疾病防治中的意義1.合理利用凋亡相關(guān)因素(yīnsù)2.干預(yù)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3.調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因4.控制凋亡相關(guān)的酶學(xué)機(jī)制5.防止線粒體跨膜電位的下降第五十七頁，共七十二頁。精選ppt1.合理利用凋亡(diāowánɡ)相關(guān)因素抑凋亡：NGF→老年性癡呆急性T細(xì)胞白血?。旱蛣┝糠派渚€、TNFα

促凋亡：局部腫瘤熱療；高溫43℃、30min前列腺癌：去勢(shì)治療2.干預(yù)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)FAS/FASL信號(hào)系統(tǒng)：阿霉素刺激SPP（神經(jīng)酰胺信號(hào)系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物）：轉(zhuǎn)導(dǎo)增殖信號(hào)，拮抗凋亡→AIDS，AD第五十八頁，共七十二頁。精選ppt3.調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因野生型P53基因轉(zhuǎn)染4.控制凋亡相關(guān)的酶核酸內(nèi)切酶：Ca2+/Mg2+依賴性Ca2+

Mg2+激活；Zn2+抑制Caspases:Ca2+直接或間接激活5.防止線粒體跨膜電位的下降環(huán)胞霉素A(cyclosporinA,免疫抑制劑）阻抑(zǔyì)ΔΨm↓，其衍生物無免疫抑制作用，但有穩(wěn)定ΔΨm↓

第五十九頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的檢測(cè)

隨著研究技術(shù)的提高和對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)不斷深入，檢測(cè)凋亡的方法已從細(xì)胞、染色質(zhì)到分子水平日趨完善和成熟。1.形態(tài)學(xué)檢測(cè)2.DNA降解分析(fēnxī)3.凋亡酶學(xué)分析4.凋亡相關(guān)蛋白分析5.流式細(xì)胞分析第六十頁，共七十二頁。精選ppt一．細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的形態(tài)學(xué)分析細(xì)胞(xìbāo)凋亡的形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為：細(xì)胞(xìbāo)皺縮(cellshrinkage)，失去細(xì)胞(xìbāo)連接(celljunction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮的新月狀體(crescents)，形成凋亡小體(apoptoticbody)等。第六十一頁，共七十二頁。精選ppt細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)方法可鑒定凋亡細(xì)胞特征光學(xué)顯微鏡相差顯微鏡透射電鏡

聚焦激光掃描電鏡掃描電鏡流式細(xì)胞儀縮時(shí)攝影術(shù)細(xì)胞體積縮小、核濃縮、細(xì)胞周圍透明圈細(xì)胞發(fā)泡、凋亡小體微絨毛消失、染色質(zhì)沿核膜分布、新月體狀核、凋亡小體凋亡細(xì)胞內(nèi)固縮染色質(zhì)及核碎片定位細(xì)胞膜表面泡狀鼓起低前向散射光(FSC)、高側(cè)向散射光(SSC)凋亡細(xì)胞的形成過程第六十二頁，共七十二頁。精選ppt二.DNA降解(jiànɡjiě)分析DNA降解過程的特點(diǎn)：1.發(fā)生于凋亡早期(zǎoqī)，由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活引起2.DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片斷3.DNA碎片可被細(xì)胞膜包裹，形成凋亡小體第六十三頁，共七十二頁。精選ppt

(一)DNA凝膠電泳原理：凋亡細(xì)胞降解產(chǎn)生一系列規(guī)則的DNA片斷，其電泳結(jié)果呈典型的“梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋亡后壞死細(xì)胞的DNA分解是隨機(jī)的，產(chǎn)生的碎片分子量大小不一，在電泳時(shí)形成“涂片狀”(smear)。普通瓊脂糖凝膠電泳、Southernblotting、放射自顯影(xiǎnyǐng)(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷的3’端)第六十四頁，共七十二頁。精選ppt(二)原位標(biāo)記法TUNEL(TdTmediateddUTPnick

endlabeling)終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)。原理：在TdT的作用下，帶有標(biāo)記物的dUTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后通過相應(yīng)的方法檢測(cè)標(biāo)記物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生(fāshēng)。應(yīng)用范圍：石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞、組織中分離的細(xì)胞 第六十五頁，共七十二頁。精選ppt(三)ELISA法

原理(yuánlǐ)：以抗組蛋白抗體包被微孔板壁，加入標(biāo)本，凋亡細(xì)胞的核小體可與抗體結(jié)合，再加入抗-DNA片斷-POD復(fù)合物，與核小體中的DNA片斷結(jié)合，最后加入POD顯色底物，以酶標(biāo)儀測(cè)定光密度以進(jìn)行定量分析。第六十六頁，共七十二頁。精選ppt三.凋亡(diāowánɡ)酶學(xué)分析1.內(nèi)切核酸酶(endonuclease,DNase)

種類(zhǒnglèi)：DNaseⅠ（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體),DNaseⅡ（溶酶體、胞核)，NUC18（胞核，胸腺細(xì)胞中)等

作用：使DNA斷裂成180－200bp或其倍數(shù)的片斷

激活機(jī)制：CAD(caspase-activateDNase)ICAD(inhibtorofCAD)