生物物理技術(shù)等溫微量量熱法

關(guān)于生物物理技術(shù)等溫微量量熱法第1頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三內(nèi)容ITC方法的基本原理ITC方法的主要優(yōu)點ITC方法的主要應(yīng)用第2頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一.ITC方法的基本原理

生物分子相互作用過程的定量描述蛋白質(zhì)P與配體L相互作用（1:1結(jié)合）：當(dāng)體系達到平衡時，結(jié)合平衡常數(shù)Ka：Ka倒數(shù)為解離平衡常數(shù)Kd：DissociateconstantKd

定量描述蛋白質(zhì)與配體的相互作用強度（affinity）mM---弱作用，μM---中等強度作用，nM---強作用第3頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三

分子結(jié)合反應(yīng)是吸熱或放熱過程復(fù)雜反應(yīng)過程：整個反應(yīng)過程能夠自發(fā)進行的條件是△G<0.

當(dāng)△H<0時，說明反應(yīng)由焓驅(qū)動；當(dāng)–T△S<0時，說明反應(yīng)由熵驅(qū)動；即△S>0,整個反應(yīng)是個熵增的過程。第5頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第6頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三量熱法（Calorimetry）在程序控溫過程中，測量熱量隨時間的變化關(guān)系

差示掃描量熱法(DSC)

等溫微量量熱法(ITC)第8頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三DSC(DifferentialScanningCalorimetry)通過檢測生物體系在控溫過程中的熱量變化，獲取與蛋白質(zhì)熱變性有關(guān)的大量信息研究：生物分子的熱穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化、熱穩(wěn)定性、熱變性的原因,

熱變性動力學(xué),

熱穩(wěn)定性與生理活性的關(guān)系，等等。根據(jù)測量方法的不同,分為：功率補償差示掃描量熱法熱流式差示掃描量熱法。第9頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC通過監(jiān)測配體滴定到蛋白質(zhì)溶液過程中的熱量變化，對結(jié)合反應(yīng)過程進行熱力學(xué)分析，直接測量多個熱力學(xué)常數(shù)，定量表征生物分子間相互作用。ITC是目前研究生物分子相互作用的最有力工具之一，常用來測量結(jié)合強度，確定結(jié)合部位個數(shù)。ITC(IsothermalTitrationCalorimetry)第11頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC儀結(jié)構(gòu)原理示意圖第12頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC儀包括兩個相同的小池，由高效導(dǎo)熱物質(zhì)(鎳合金)制成，外面包圍著隔熱套。靈敏的熱電堆/熱電偶電路可檢測兩小池以及小池與隔熱套之間的溫差。

靶蛋白溶液放在樣品池中，小分子由計算機控制的步進電動機通過注射器精確地滴加到樣品池中，同時攪拌樣品池中液體，使反應(yīng)物迅速混合。在滴加滴定劑前，一個穩(wěn)定的電功率加到對照池上，通過反饋電路激活樣品池上的加熱器，代表了基線的信號。

實驗中直接觀察的是為了保持樣品池和對照池溫度相等隨時間變化所要求的電功率輸入。

在滴加過程中，熱量變化取決于結(jié)合反應(yīng)是吸熱反應(yīng)還是放熱反應(yīng)。反饋電路對樣品池增加或減少電功率，保持兩池溫度相等。第13頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第14頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三對單個結(jié)合部位的結(jié)合，滴定小分子引起的熱量變化：V0是樣品池的體積，△Hb是蛋白質(zhì)結(jié)合配體引起的焓變化，[M]t

是蛋白質(zhì)總濃度，[L]是自由配體濃度在量熱滴定過程中，反應(yīng)涉及的熱量與結(jié)合的小分于是成比例的滴定開始時，大部分加入的小分子都與靶標(biāo)分子結(jié)合，導(dǎo)致了大的吸熱或放熱信號；隨著配體濃度的增加，蛋白分子逐漸被飽和，隨后再滴加滴定劑，則少量的熱量被吸收或放出。第15頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三對多個獨立結(jié)合部位的結(jié)合，滴定小分子引起的熱量變化總量：第16頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC典型滴定曲線第17頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三一次ITC實驗就可以同時測定Ka，N,△Haa第18頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第19頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三定義無量綱的C值：C=Ka[M]N要精確測定結(jié)合常數(shù)，C：1-1000，C值太大限制了Ka的測定，因為滴定曲線太陡，在接近平衡時，收集的數(shù)據(jù)太少；C值太小，則得不到典型的S型曲線，曲線太寬，接近線性，不能得到等值點。第20頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三1.相同的蛋白質(zhì)濃度，結(jié)合力Ka--》減少2.相同的Ka，蛋白質(zhì)濃度Mtot

---》升高第22頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC實驗設(shè)計第23頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三不同C值的ITC滴定曲線第24頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例子-1：μM結(jié)合的實驗數(shù)據(jù)

4-carboxybenzenesulfonamidemolarratio對磺酰胺基苯甲酸第25頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三例子-2：mM結(jié)合的實驗數(shù)據(jù)甲砜胺第26頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三二.ITC方法的優(yōu)點對研究體系的溶劑、光譜和電學(xué)等性質(zhì)沒有限制。方法靈敏度和精確度高

MicroCal型號：最小可檢測熱功率2nW，最小可檢測熱效應(yīng)125nJ，生物樣品最小用量0.4μg，響應(yīng)時間小于10s?？色@得生物分子相互作用完整的熱力學(xué)數(shù)據(jù)：

結(jié)合常數(shù)Ka,結(jié)合位點數(shù)n,結(jié)合焓△H，

恒壓熱容△Cp，動力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的Km和kcat）。第27頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三實驗時間較短(典型ITC實驗只需30-60分鐘)精確度高，操作簡便計算機控制實驗過程，使用者只需輸入實驗的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，由計算機完成整個實驗，并用Origin軟件分析ITC數(shù)據(jù)。測量時不需要制成透明清澈的溶液,無損檢測量熱實驗后樣品可以進行后續(xù)生化分析。第28頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITC系統(tǒng)的性能第29頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三MicroCalITC產(chǎn)品第30頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三三.ITC方法的應(yīng)用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：抗原-抗體相互作用，分子伴侶-底物相互作用，等等。蛋白質(zhì)-小分子相互作用，酶-抑制劑相互作用蛋白質(zhì)-核酸相互作用核酸-核酸相互作用核酸-小分子相互作用生物分子-細(xì)胞相互作用DNA/RNA-藥物相互作用酶促反應(yīng)動力學(xué)蛋白質(zhì)折疊/去折疊RNA折疊第33頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三1.研究Ras，Cdc42與底物（effector）的結(jié)合ThermodynamicsofRas/EffectorandCdc42/EffectorInteractionsProbedbyIsothermalTitrationCalorimetryHerrmannC.,J.Biol.Chem.276:23914-23921(2001).

Ras是一種在信號傳導(dǎo)過程中起重要作用的蛋白質(zhì)，可以向其下游的許多信號傳導(dǎo)途徑輸送細(xì)胞內(nèi)調(diào)控信號。Ras在非激活態(tài)與GDP結(jié)合，當(dāng)GDP被GTP取代時被激活，與底物（Raf，RalGDS,3-磷脂酰肌醇激酶）發(fā)生緊密的結(jié)合。

Cdc42是一種GTPase,也是信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白，它參與細(xì)胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。CdC42在參與細(xì)胞骨架調(diào)控的過程中，重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。第34頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第35頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三6μM50μM6μM50μM第36頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三第40頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三Structureandcharacterizationofanovalchickenbiotin-bindingproteinA(BBP-A).HytonenV.P.,etal.BMCStructuralBiology,7:8(2007).

BBP—A是一種類抗生素蛋白（AVD）,具有β折疊的結(jié)構(gòu)，對BTN具有高親和力，但具有不同于其他抗生素蛋白家族成員的熱穩(wěn)定性和免疫學(xué)特性。BBP—A擁有特異的結(jié)合BTN和BSO的配體結(jié)合特性，目前作為生物工藝學(xué)新材料得到應(yīng)用。2.檢測BBP—A和AVD與BTN和BSO結(jié)合能力的差異第41頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三ITCanalysisofbBBP-AandAVDforBindingBTNandBSO:AVD-BTN,AVD–BSO,(c)AVD-D-biotinsulfone,(d)bBBP-A–BTN,(e)bBBP-A–BSO(f)bBBP-A–D-biotinsulfone第42頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三3.其它一些應(yīng)用例子第43頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用第44頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)-配體相互作用WrightandSerpersu,Biochemistry,44:11581-11591(2005).妥布霉素是一種對革蘭氏陰性菌、多種革蘭氏陽性菌有作用的氨基糖苷類抗生素氨基糖苷核苷轉(zhuǎn)移酶妥布霉素第45頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)-配體相互作用CooperA,etal.,FEBSLett.348:41-45(1994).SAM---腺苷甲硫氨酸第46頁，講稿共51頁，2023年5月2日，星期三LiJ.andWeisR.M.(1996)蛋白質(zhì)-受體相互作用第47頁，講稿共51頁，2023年