熒光分析與化學(xué)發(fā)光分析

關(guān)于熒光分析與化學(xué)發(fā)光分析第1頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

6-1概述

在前兩章中我們討論了物質(zhì)對電磁輻射的吸收。吸收輻射能后，處于電子激發(fā)態(tài)的分子在返回基態(tài)時以發(fā)射輻射的方式釋放這一部分能量，發(fā)射的輻射波長可以同分子所吸收的輻射波長相同，也可不相同，這一現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。最常見的兩種光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。這兩種光致發(fā)光過程的機理不同(見§6-2)，可通過實驗觀察激發(fā)分子壽命的長短來加以區(qū)別。對于熒光，當(dāng)激發(fā)光停止照射后，發(fā)光過程幾乎立即停止(10-9～10-6)，而磷光則將持續(xù)一段時間(10-3

～

10s)。第2頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

一般所謂熒光現(xiàn)象是指物質(zhì)吸收紫外光后所發(fā)射出的可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后所發(fā)射出的波長較長的可見光熒光。但實際上熒光現(xiàn)象并不限于這些情況。有些物質(zhì)吸收了比紫外光波長短得多的Ⅹ光后，發(fā)射出波長比所吸收的Ⅹ光波長稍長的Ⅹ光，這稱為Ⅹ光熒光，并據(jù)此建立了Ⅹ光熒光分析法(有關(guān)此法的詳細討論見第十四章)。此外，有些物質(zhì)吸收了紅外光后發(fā)射出波長稍長的紅外光，這稱為紅外光熒光。近年來，隨著紅外探測器靈敏度的不斷提高，紅外光熒光分析法已應(yīng)用于許多有機物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。第3頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

由于物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外光波長和發(fā)射的熒光波長也有所不同，利用這個特征可以對物質(zhì)進行定性鑒定。同一種分子結(jié)構(gòu)相同的物質(zhì)，用同一種波長的紫外光照射激發(fā)，可發(fā)射特征波長的熒光，其強度與物質(zhì)的量有關(guān)。據(jù)此，可利用某些物質(zhì)被紫外光照射后所發(fā)射的能反映出該物質(zhì)特性的熒光進行定性以及定量分析，這種分析稱為熒光分析。第4頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

化學(xué)發(fā)光分析是利用化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象進行分析測定的一類方法。與熒光分析一樣，屬于發(fā)光分析的范疇?；瘜W(xué)發(fā)光與熒光分子的發(fā)光相似，他的大部分性質(zhì)和熒光相同，不同點在于熒光的激發(fā)能來自外光源的激發(fā)(照射)，而化學(xué)發(fā)光的激發(fā)能則產(chǎn)生自化學(xué)反應(yīng)，也即某些物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學(xué)能，使分子或原子被激發(fā)，這種受激分子或原子返回基態(tài)時，以光輻射的方式釋放能量。其光輻射的能量及光譜范圍由化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)所控制(處于可見光區(qū))。每一個化學(xué)反應(yīng)都有其特征的化學(xué)發(fā)射光譜，其發(fā)光強度則與物質(zhì)的濃度有關(guān)，這是化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)。第5頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

此外還有其他類型的發(fā)光:生物發(fā)光、熱致發(fā)光、放射發(fā)光(放射性分解引起激發(fā))、聲致發(fā)光(聲波激發(fā))、點發(fā)光(電激發(fā))、摩擦發(fā)光(機械能激發(fā))等。其中生物發(fā)光在分析化學(xué)中得到重要的應(yīng)用，在生物發(fā)光中導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的化學(xué)反應(yīng)是在生物體內(nèi)進行的。磷光現(xiàn)象也被用于分析目的，但應(yīng)用范圍有限。第6頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三§6-2熒光分析法基本原理熒光定性分析熒光定量分析熒光計與熒光分光光度計第7頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

1.熒光的發(fā)生處于基態(tài)的分子吸收一定波長的輻射能后。電子發(fā)生躍遷。此時由原來的能級躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)或第二電子激發(fā)態(tài)中各個不同振動能級和各個不同的轉(zhuǎn)動能級，如圖6-1中(a)和(b)所示。分子在吸收了光而被激發(fā)至第一或更高的電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級之后，通常急劇降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級，在這一過程中他們和同類分子或其他分子(例如溶劑分子)碰撞而消耗了相當(dāng)于這些能級之間的能量，因而不發(fā)射光(無輻射躍遷，圖6-1中c)。由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級繼續(xù)往下降落至基態(tài)的各個不同能級時，則以光的形式發(fā)射，所發(fā)生的光即熒光(圖6-1中d)。某些物質(zhì)的分子在被激發(fā)至較高的能級并通過無輻射躍遷降落至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級之后，并不繼續(xù)直接降落至基態(tài)，而是通過另一次無輻射躍遷至一個中間的亞穩(wěn)的能級——三重態(tài)(圖6-1中e)。一、基本原理第8頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

已知電子激發(fā)態(tài)的自旋多重性為2S+1，S是自旋量子數(shù)的代數(shù)和。大多數(shù)分子含有偶數(shù)電子，在基態(tài)時這些電子成對地存在于各個原子或分子軌道中。然而，根據(jù)保利不相容原理，在一個軌道上的這兩個電子的自旋是相反的，自旋量子數(shù)為+?(↑)和-?(↓)。由于自旋成對的結(jié)果，大多數(shù)分子的自旋量子數(shù)的代數(shù)和S=0，此時這個分子所處的電子能態(tài)稱為單重態(tài)(singletstate)，即2S+1=1。如果分子中有一個未成對的電子，則S=?，而2S+1=2，此種狀態(tài)稱為雙重態(tài)(doubletstate)。若分子中有兩個未成對的電子，此時S=1,2S+1=3，這種狀態(tài)稱為三重態(tài)(tripletstate)。第9頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

在基態(tài)分子的一個電子吸收光輻射而被激發(fā)的過程中，通常它的自選不變(△S=0)，則激發(fā)態(tài)仍是單重態(tài)，如圖6-2所示。某些分子的激發(fā)單重態(tài)通過無輻射躍遷，在體系間跨越的過程中發(fā)生自選反轉(zhuǎn)，造成兩個電子自旋平行的狀態(tài)，也即是激發(fā)三重態(tài)(6-2)。第10頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

這些分子在三重態(tài)稍事逗留后，在發(fā)射輻射而下降至單重態(tài)各振動能級，所發(fā)射的光即為磷光(圖6-1中f)。因自三重態(tài)降落至單重態(tài)時所給出的能量比由單重第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級直接降落至單重基態(tài)時所給出的能量小，所以磷光的波長比熒光波長長。如將溫度降低，則由三重態(tài)降落至單重態(tài)的時間將大為延遲，在很低的溫度下，這些分子有可能被“凍結(jié)”在三重態(tài)上。某些分子在躍遷至三重態(tài)后，通過熱激活作用可以再回到第一電子激發(fā)態(tài)的各個振動能級，然后再由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級降落至基態(tài)而發(fā)射出熒光，這種熒光就被稱為遲滯熒光(圖6-1中g(shù)和f)。第11頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

如果把蒽的乙醇溶液裝入試管，并放在液氮中，并用紫外光照射，停止照射后，還能見到蒽溶液輻射出的橙色光，而光的強度隨時間的延長而逐漸變?nèi)?，最終消失為止。這種即使停止用光激勵，還能繼續(xù)發(fā)光的現(xiàn)象，就是蒽的磷光。圖6-3表明了蒽吸收了波長366nm的光，生成最低激發(fā)單重態(tài)S1，S1輻射熒光到基態(tài)，同時激發(fā)單重態(tài)S1體系間跨越到三重態(tài)T1，T1輻射磷光回到基態(tài)。第12頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三2.熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜簡稱熒光光譜，它表示該熒光物質(zhì)所發(fā)射的熒光中各種不同波長組分的相對強度，是以熒光強度對熒光波長所繪制的曲線。如果把某物質(zhì)的熒光光譜與他的吸收光譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)這兩種光譜之間存在著密切的“鏡像對稱”關(guān)系。熒光光譜好像是吸收光譜照在鏡子中的像，但又比吸收光譜缺少了一些短波長的吸收峰。圖6-4表示蒽的乙醇溶液的熒光光譜和吸收光譜。第13頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三3.化合物的熒光和化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系產(chǎn)生熒光必須具備兩個條件。首先，物質(zhì)分子必須具有能吸收紫外或可見光的生色基團；其次該物質(zhì)應(yīng)具有一定的熒光效率。分子中能發(fā)射熒光的基團，稱為熒光基團。熒光基團一定是生色基團，但生色基團未必一定是熒光基團。這是由于它的熒光效率不高，而將所吸收的能量消耗于與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子之間的相互碰撞，因此不能發(fā)射熒光。熒光效率(ΦF)又稱為熒光量子產(chǎn)率，是熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光量子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的量子數(shù)的比值，即

ΦF=

此外，一種物質(zhì)吸收光的能力及量子產(chǎn)率又與物質(zhì)所處的環(huán)境緊密相關(guān)，因為環(huán)境條件(如溶劑、pH、溫度等)常常是物質(zhì)量子產(chǎn)率高低，甚至能否產(chǎn)生熒光的重要因素。發(fā)射的量子數(shù)吸收的量子數(shù)第14頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

熒光通常發(fā)生于具有剛性平面結(jié)構(gòu)的π電子共軛體系的分子中，隨著π電子共軛度和分子平面度的增大，熒光效率也將增大，它們的熒光光譜也將移向長波方向。任何有利于提高π電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，使熒光波長向長波長的方向移動。絕大部分的熒光(磷光)物質(zhì)都是環(huán)狀化合物(芳香環(huán)或雜環(huán))，芳香環(huán)越多，熒光效率越高，熒光光譜也移向長波長方向(表6-1)。但環(huán)狀結(jié)構(gòu)并不是發(fā)生熒光的絕對條件，如吡啶()、呋喃()、噻吩()和吡咯()是非熒光或弱熒光物質(zhì)。但取代上苯基后，由于共軛體系的增大，熒光效率將大為增加。例如苯并呋喃()、吲哚硫茚的熒光和笨相近。第15頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

在芳香化合物的芳環(huán)上進行不同基團的取代，對該化合物的熒光強度和熒光光譜都將產(chǎn)生影響。通常有以下一些規(guī)律：

(1)給電子基團常使熒光增強，因為它們使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。作用特別明顯的基團是-NH2和-OH。

(2)同π電子體系相互作用小的取代基如-SO3H、-NH3和烷基等，對熒光影響小。

(3)吸電子基團如-COOH、-NO2、-N=N-及鹵素會減弱甚至破壞熒光。

(4)重原子或雜原子引入到π電子體系中常會減弱熒光，所以苯胺和苯酚的熒光較苯強20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯則是非熒光或弱熒光物質(zhì)。表6-2表明取代基對苯的熒光的影響。+第16頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

具有剛性平面結(jié)構(gòu)的分子有利于熒光的產(chǎn)生。這可以比較熒光素和酚酞的結(jié)構(gòu)來說明:

又如芴和聯(lián)苯在類似的測量條件下的熒光效率分別為1.0和0.2。這是由于芴上的亞甲基增強了分子的剛性的緣故。

有些有機分子本身不會發(fā)熒光，但與金屬形成絡(luò)合物后，由于增強了他的剛性并大大減少了分子的內(nèi)振動作用，因而產(chǎn)生熒光。第17頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

前文已述，由于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的紫外波長和發(fā)射的熒光波長具有特征性，因此根據(jù)熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可鑒別化合物。最直接的熒光定性分析方法是將待分析的熒光發(fā)射光譜與預(yù)期化合物的熒光發(fā)射光譜相比較。這種方法比較簡便并常能取得較好的效果。圖6-5(a)(b)是從一個城市河流底泥試樣中以熒光法鑒定苯并(α)芘的實例。二、熒光定性分析

圖6-5苯并(α)芘和苯并(κ)芘的熒光激發(fā)光譜及發(fā)射光譜第18頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

對于一些復(fù)雜的樣品來說，光譜鑒定有時會發(fā)生困難?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)加入的辦法。即在試樣中添加擬存在的組分，若此組分存在，則在添加該組分的純物質(zhì)加入后，該物質(zhì)的特征峰將加強。同步掃描熒光法可使光譜簡化和窄化，是原來互相重疊的光譜分辨開來，從而提高了熒光法的選擇。同步掃描法通常在固定Δλ時進行，此時使激發(fā)單色器和發(fā)射單色器的波長差Δλ(Δλ=λEm-λEn)保持固定地同時進行掃描，所得譜圖稱為同步光譜，所測得的熒光信號為同步信號。第19頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

圖6-7菲、蒽、苝的光譜圖圖6-8萘、菲、蒽、苝、并四苯混合物的常規(guī)熒光光譜及混合物的同步光譜圖圖6-9工廠區(qū)大氣樣品萃取物中強致癌物苯并(α)芘及其共存物的熒光光譜和同步光譜第20頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三1.熒光強度與濃度的關(guān)系熒光的發(fā)光是由于物質(zhì)在吸光之后發(fā)射出波長較長的熒光，因此溶液的熒光強度與該溶液的吸光程度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。溶液被入射光(I0)激發(fā)后，可以在溶液的各個方向觀察到熒光強度(F)。但由于激發(fā)光源能量的一部分被透過，因此，在透射光的方向觀察熒光是不適宜的。一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀測。根據(jù)比耳定律，透過光的比例為

式中：I0為入射光(激發(fā)光)強度；I為透過光強度；C為濃度，b為液層厚度；ε為摩爾吸光系數(shù)。相應(yīng)地被吸收的部分是將上式重新排列，可得被吸收的光的量為

I0-I=I0(1-10)(6-3)

三、熒光定量分析II0-=10-εbC-εbC1--=1-10I0I-εbC(6-2)(6-1)第21頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

總的熒光強度(F)同試樣吸收的激發(fā)光的光量子數(shù)目和熒光量子效率(ΦF)成正比

F=ΦF(I0-I)=I0ΦF(1-10)(6-4)

將上式括弧中指數(shù)項展開可得

F=I0ΦF[](6-5)

對于很稀的溶液，投射到試樣溶液上被吸收的激發(fā)光不到2％時，也就是εbC

=A＜0.05時，括弧內(nèi)第二項以后可以忽略不計，則上式可簡化為

F=2.3ΦFεbC

I0(6-6)

對于一定的熒光物質(zhì)，當(dāng)分析條件及儀器使用條件確定后，上式中ΦF、

ε、b、I0均為常數(shù)，當(dāng)被測熒光物質(zhì)的濃度C很小時(εbC

≤0.05)，式(6-6)可寫作

F=kC(6-7)

即熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。但當(dāng)εbC

增大時，從式(6-5)可以看出濃度與熒光強度之間呈非線性關(guān)系，若εbC

很大時，式(6-5)成為

F=I0ΦF

(6-8)

此時熒光強度與濃度無關(guān)。因此在熒光分析中，熒光強度和濃度的線性關(guān)系僅限于很稀的試液。-εbC2.3

εbC-———————-———————···(-2.3εbC)2!(-2.3εbC)3!23第22頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三2.影響熒光強度的因素

(1)激發(fā)光照射的影響對于容易分解的熒光物質(zhì)的測定，應(yīng)通過實驗確定能準(zhǔn)確讀取熒光強度的方法。

(2)溫度影響通常熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低而熒光強度增大。一般溫度升高1℃，熒光強度約下降1％。

(3)溶劑影響一般來說，熒光強度隨著溶劑極性的增大而增強。

(4)溶液pH的影響當(dāng)熒光物質(zhì)為弱酸或弱堿時，溶液pH值的改變對熒光強度將有很大的影響。對于金屬離子與有機試劑形成的絡(luò)合物，溶液pH值的改變還會影響到絡(luò)合物的組成，從而影響到它們的熒光性質(zhì)。

(5)各種發(fā)散光的影響主要是散射光和拉曼光。降低方法:從儀器上考慮；從溶劑考慮。

(6)熒光熄滅熒光物質(zhì)和溶劑或其它溶質(zhì)分子的互相碰撞或電子轉(zhuǎn)移等作用引起的。鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等都是顯著地?zé)晒庀鐒?/p>

(7)熒光自滅熒光物質(zhì)的濃度大于1g·L時，常發(fā)生熒光的自滅現(xiàn)象。由上述可見，最適宜的測定條件如pH、溶劑、試劑的濃度、溫度以及熒光強度最大時所需的時間等都需要試驗來確定。

第23頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三3.定量分析方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光分析一般多采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(工作曲線)法，尤其在測定大批樣品的例行測定時更是如此。

(2)直接比較法取已知量的純熒光物質(zhì)配制一標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在線性范圍內(nèi)，測定熒光強度(Fs)。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度(Fx)。由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(Cs)和兩個溶液的熒光強度，求試樣中熒光物質(zhì)的含量(Cx)。在空白溶液的熒光強度若未能使儀器讀數(shù)調(diào)至0％，則必須從Fs及Fx值中扣除空白溶液的熒光強度(F0)，然后進行計算。根據(jù)式(6-6)可得

Fs-F0=

2.3ΦF

εbI0Cs

Fx-F0=

2.3ΦF

εbI0Cx

因為對于同一熒光物質(zhì)，ΦF及

ε相同，且b一定，故

(3)熒光熄滅法利用熒光熄滅現(xiàn)象可對某些物質(zhì)進行定量測定。

(4)同步掃描熒光法同步熒光信號的強度與欲測熒光物質(zhì)的濃度(濃度很稀時)呈線性關(guān)系。但是，同步熒光法存在濃度效應(yīng)。欲克服，只需將溶液適當(dāng)稀釋即可。F=2.3ΦFεbC

I0

(6-6)Fs-F0CsFx-F0Cx———=—Cx=Cs———(6-9)Fx-F0Fs-F0第24頁，講稿共27頁，2023年5月2日，星期三

測定熒光強度的儀器有目測熒光計、光電熒光計和熒光分光光度計等。它們主要由光源、濾光片、或