免疫學(xué)方法及其應(yīng)用修改

免疫學(xué)方法及其應(yīng)用修改第1頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月病原微生物感染機(jī)體對抗免疫免疫學(xué)幾個基本概念免疫(immunity)：是人和動物機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，其作用是“識別”和排除抗原性“異物”，以維持機(jī)體生理的平衡和穩(wěn)定。免疫學(xué)：研究機(jī)體自我識別和對抗原性異物排斥反應(yīng)的一門科學(xué)。傳統(tǒng)的免疫概念：機(jī)體抵抗病原微生物的能力，即抗傳染免疫1.免疫和免疫學(xué)第2頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：具有自身的運(yùn)行機(jī)制并可與其他系統(tǒng)相互配合、相互制約，共同維持機(jī)體在生命過程中總的生理平衡。免疫系統(tǒng)的任務(wù)是消滅“異己”“異己”來自兩個方面:外來的入侵者：侵入身體的各種致病菌包括哪些？(2)“變壞了的”自身細(xì)胞。細(xì)胞癌變第3頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫系統(tǒng)的生理功能①免疫防御——機(jī)體排斥外源性抗原異物的能力。②免疫自穩(wěn)——機(jī)體識別和清除自身衰老殘損的組織、細(xì)胞，維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。③免疫監(jiān)視——機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞，機(jī)體監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。第4頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(1)探針帶來細(xì)菌入侵(2)吞噬細(xì)胞趕赴“現(xiàn)場”(3)消滅入侵恢復(fù)健康第5頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

機(jī)體防御機(jī)制人體第一道防線———天然免疫(非特異性免疫)屏障結(jié)構(gòu)、非特異性免疫細(xì)胞和免疫分子組成。人體第二道防線———獲得性免疫(特異性免疫)分類：體液免疫細(xì)胞免疫第6頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

抗感染免疫的構(gòu)成因素天然免疫與獲得性免疫的關(guān)系◆在抗感染免疫過程中，天然免疫與獲得性免疫相互依賴與協(xié)作，共同發(fā)揮消除病原微生物感染的作用。第7頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月吞噬細(xì)胞的吞噬和殺菌過程示意圖第8頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)特異性免疫包括兩個基本內(nèi)容：（1）免疫原性：抗原刺激有機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的能力；（2）反應(yīng)原性：抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力；抗原性：免疫原性和反應(yīng)原性的統(tǒng)稱。

三免疫分子及其在體液免疫中的作用㈠、抗原與抗體簡介抗原(antigen)

定義：凡是能刺激有機(jī)體(人或動物體)產(chǎn)生抗體，并能與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。第9頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)、抗原1、抗原的基本性質(zhì)（1）異物性（2）大分子量（3）特異性

抗原刺激機(jī)體后只能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體并能與之結(jié)合。

特異性是由抗原表面的抗原決定基(簇)決定的。

抗原決定基（表位）：抗原分子中決定抗原特異性的基本結(jié)構(gòu)或具有化學(xué)活性的基團(tuán)?？乖瓫Q定基是與抗體特異性結(jié)合的基本單位。（4）化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜

免疫原性的形成還要求蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。極性基團(tuán)愈多或含支鏈氨基酸愈多，以及帶芳香族氨基酸多的蛋白質(zhì)抗原性愈強(qiáng)。

第10頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗原的種類按抗原性的完整與否及其在機(jī)體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的特點(diǎn)，可分為完全抗原和不完全抗原。（1）完全抗原與不完全抗原①完全抗原既有免疫原性又有反應(yīng)原性。即能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并與產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)或體外(試管內(nèi))發(fā)生反應(yīng)的抗原。

如細(xì)菌、病毒、外毒素、血清白蛋白、花粉蛋白、②不完全抗原（半抗原）只有反應(yīng)原性而沒有免疫原性。即不能單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，若與蛋白質(zhì)或膠體顆粒結(jié)合，形成大分子復(fù)合物成為完全抗原，則可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

如各種低分子量的藥物、脂類和多糖等都屬于不完全抗原。第11頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）細(xì)菌抗原第12頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月①菌體抗原（O抗原）在細(xì)胞壁上，主要抗原。主要成分為脂多糖。根據(jù)O抗原的組成不同進(jìn)行分群。O抗原耐熱，121℃，2h不被破壞。如沙門氏菌屬的O抗原不同分成67個血清群。

②鞭毛抗原（H抗原）在鞭毛中，由蛋白質(zhì)組成，具有不同的種和型特異性，可作菌型鑒別。H抗原不耐熱，56～80℃，30～40min即被破壞。在制備O抗原時常用煮沸法消除H抗原。2、抗原的種類（2）細(xì)菌抗原第13頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月③表面抗原（表面抗原）包圍在細(xì)菌細(xì)胞壁最外面，故稱。表面抗原隨菌種和結(jié)構(gòu)的不同可有不同的名稱。如肺炎鏈球菌——莢膜抗原；大腸桿菌、痢疾志賀氏菌——包膜抗原或K抗原，沙門氏菌屬——Vi抗原等。④菌毛抗原

存在于菌毛中的抗原，也具有特異的抗原性。⑤外毒素和類毒素

細(xì)菌外毒素具有很強(qiáng)的抗原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素抗體。外毒素經(jīng)0.3%～0.4%甲醛溶液處理后使其失去毒性，但仍保持抗原性，即成為類毒素。2、抗原的種類（2）細(xì)菌抗原第14頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)、抗體(antibody,Ab)定義：抗原刺激有機(jī)體(人或動物)所產(chǎn)生的具有特異性的免疫球蛋白?？贵w是由B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一類糖蛋白，能與相應(yīng)抗原表位結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的重要免疫分子。分泌型(secretedIg,sIg)：膜型(membraneIg,mlg)：在血清和組織液中，占全部機(jī)體血清的20%～25%。具有抗體的各種免疫功能是B細(xì)胞表面的抗原受體。含有免疫球蛋白的血清，稱為免疫血清或抗血清。第15頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)、抗體1、抗體的性質(zhì)（1）免疫球蛋白是一種糖蛋白，具有蛋白質(zhì)的通性。凡能破壞球蛋白的各種理化因素均能使之滅活；能被多種蛋白水解酶裂解；可以在乙醇、三氯醋酸或中性鹽類中沉淀，生產(chǎn)上常用50%飽和硫酸銨或硫酸鈉從免疫血清中提取抗體球蛋白。（2）在體外(試管內(nèi))，抗體可與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合并出現(xiàn)可見反應(yīng)；在體內(nèi)，與其他防御機(jī)能協(xié)同作用下殺滅病原菌，起到抗感染作用。但某些抗體在機(jī)體內(nèi)與相應(yīng)的抗原相遇時，能引起變態(tài)反應(yīng)。如青霉素過敏等。第16頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）由不同細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體具有不均一性和結(jié)構(gòu)的多樣性。

例如將血清電泳時，免疫球蛋白主要分布于γ球蛋白區(qū)，因而曾稱抗體為γ球蛋白，也有少量延伸到β區(qū)和α2區(qū)?？贵w作為一種球蛋白，對異種動物又是很好抗原。因此,抗體即是抗體，又是抗原。利用此種特性可以制備抗免疫球蛋白抗體(或稱抗抗體)，用于熒光抗體技術(shù)中(間接法)。1、抗體的性質(zhì)第17頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)兩條重鏈(H鏈)兩條輕鏈(H鏈)440個氨基酸殘基組成，分子量約50～70kD220個氨基酸組成，分子量約22.5kD。二硫鍵(-S·S-)根據(jù)重鏈的氨基酸順序同源程度的差異，可將Ig分為類和亞類。人的免疫球蛋白共5類：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE第18頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)N端可變區(qū)恒定區(qū)鍵間二硫鍵輕鏈重鏈C端CDR區(qū)識別抗原構(gòu)架區(qū)第19頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月2、抗體的基本結(jié)構(gòu)第20頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月①免疫抗體3、抗體的種類

（1）根據(jù)抗體獲得方式分類②天然抗體③自身抗體（2）根據(jù)抗體作用對象分類①抗菌性抗體②抗毒性抗體③抗病毒性抗體④過敏性抗體動物患傳染病后或經(jīng)人工注射疫苗后產(chǎn)生動物先天就有的抗體，可以遺傳給后代

機(jī)體對自身組織成分產(chǎn)生的抗體

細(xì)菌或內(nèi)毒素刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體

細(xì)菌外毒素刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體

病毒刺激機(jī)體而產(chǎn)生的抗體，阻止病毒侵害異種動物血清進(jìn)入機(jī)體后所產(chǎn)生的使動物發(fā)生過敏反應(yīng)的抗體

第21頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、人工制備抗體（1）多克隆抗體(polyclonalantibody，PoAb)定義：

將抗原免疫動物，刺激動物體內(nèi)多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體，是針對多種抗原決定基的混合抗體。特點(diǎn)：來源廣泛、制備容易，但不易大量制備；特異性不高，常出現(xiàn)交叉反應(yīng)；評價：應(yīng)用受到限制。第22頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)

原理:淋巴細(xì)胞增殖分化的漿細(xì)胞

(來自脾臟，有抗原特異性,能產(chǎn)生抗體，但短壽)

骨髓瘤細(xì)胞

(無抗原特異性，但長壽，能在體外無限繁殖)

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，

獲得既能在體外培養(yǎng)又能產(chǎn)生單一抗體的雜交瘤細(xì)胞。特點(diǎn)：純度高、特異性強(qiáng)、效價高、無或少血清交叉反應(yīng)，制備成本低等特性。已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

第23頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、人工制備抗體單克隆抗體制備示意圖第24頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體制作過程第25頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、人工制備抗體（2）單克隆抗體(monoclonalantibody，McAb)

應(yīng)用：已廣泛用作臨床診斷試劑或生化治療劑。

①對微生物病原體的鑒定。②特異性抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測和鑒定。③疾病的被動免疫治療和生物導(dǎo)向藥物的制備。④檢測血液中的藥物含量。⑤分離某些昂貴的生物活性物質(zhì)。

第26頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、人工制備抗體（3）基因工程抗體（重組抗體）在基因水平上對Ig分子進(jìn)行切割、拼接或修飾，重新組裝成的新型抗體分子。。特點(diǎn)：保留天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少了無關(guān)結(jié)構(gòu)，并可賦予抗體分子以新的生物學(xué)活性。迄今已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，如人-鼠嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、雙特異性抗體(BsAb)及噬菌體抗體等。

第27頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月一.抗原與抗體反應(yīng)的一般規(guī)律抗原抗體反應(yīng)：抗原與相應(yīng)抗體之間在體內(nèi)或體外所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。體內(nèi)反應(yīng)：介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)：根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多用血清作試驗(yàn)，故體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)。第四節(jié)免疫學(xué)方法及其應(yīng)用第28頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)1.特異性與交叉性

特異性：一種抗原只能與它相應(yīng)的抗體結(jié)合。交叉性：兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，就可出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2.可逆性

抗體與抗原的結(jié)合是分子表面的一種物理結(jié)合即非共價鍵的結(jié)合，在一定條件下可以發(fā)生解離。分開后，二者的性質(zhì)不變。3.定比性

抗原物質(zhì)是多價的；抗體是雙價的?？乖贵w的結(jié)合是抗原—抗體—抗原—抗體這樣順次結(jié)合，只有當(dāng)兩者比例合適時，聚集成較大的復(fù)合物才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。第29頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)3.定比性圖7-4沉淀反應(yīng)的曲線每一個Y字形的Ig單體分子能結(jié)合2個抗原表位，稱之為兩價；分泌型IgA為4價；五聚體IgM理論上為10價，但由于立體構(gòu)型的空間阻位，一般只能結(jié)合5個抗原表位。第30頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原抗體反應(yīng)的一般特點(diǎn)4.階段性

第一階段：發(fā)生特異性反應(yīng)，特點(diǎn)是反應(yīng)快，不被肉眼所見。第二階段：可見階段，是非特異性的。反應(yīng)較慢，受到電解質(zhì)、pH值和溫度的影響。5.敏感性

高度的敏感性，用于定性，還可用于定量和定位。第31頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月影響抗原抗體反應(yīng)的因素1.電解質(zhì)4.雜質(zhì)異物0.85％的NaCl生理鹽水2.溫度37℃水浴3.pH值多數(shù)血清學(xué)反應(yīng)的適宜pH值為6～8第32頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月二、抗原、抗體間的主要反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、免疫電泳4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

第33頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要抗原抗體反應(yīng)(一)、凝集反應(yīng)

定義：顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在有電解質(zhì)合適條件下反應(yīng)并出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)現(xiàn)象。（凝集原，凝集素）一般稀釋抗體(抗血清)，使其與抗原有一合適比例。1直接凝集反應(yīng)①玻片法

定性試驗(yàn)。用已知抗體檢測未知抗原。

用途：鑒定菌種，菌種分型，測定ABO血型等。

②試管法

定量試驗(yàn)。用已知抗原測定血清中抗體有無及相對含量發(fā)生明顯凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度（抗體效價，滴度

)，以表示血清中抗體的相對含量。

用途：測定患傳染病的人或家畜血清中的抗體，診斷第34頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要抗原抗體反應(yīng)2.間接凝集反應(yīng)定義：利用某些與免疫無關(guān)的均一的小顆粒物質(zhì)作為載體，將可溶性抗原(或抗體)吸附于表面，如與相應(yīng)的抗體

(或抗原)結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，發(fā)生凝集現(xiàn)象。表面吸附抗原(或抗體)的載體微球稱為免疫微球。特點(diǎn)：增大體積，敏感，可檢測極微量抗原。根據(jù)所用載體不同，常用的間接凝集反應(yīng)有間接血球凝集反應(yīng)，碳凝集反應(yīng)，乳膠凝集反應(yīng)等。還有間接凝集抑制反應(yīng)，第35頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要抗原抗體反應(yīng)(二)、沉淀反應(yīng)定義：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適量電解質(zhì)存在條件下，形成肉眼可見的沉淀物。（沉淀原，沉淀素）

凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的區(qū)別：凝集反應(yīng)的抗原是顆粒性抗原，總表面積小，做抗體稀釋。沉淀反應(yīng)的抗原是可溶性的膠體溶液，單位面積抗原多，需抗體量多，抗原稀釋。

以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價。類型：環(huán)狀法、絮狀法和瓊脂擴(kuò)散法（單向和雙向）。第37頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要抗原抗體反應(yīng)圖7-5瓊脂雙向擴(kuò)散的幾種不同方式結(jié)果示意圖第38頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、免疫電泳將瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。

特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、很高的靈敏性和分辨力。用途：分析抗原或抗體純度。

類型：對流免疫電泳、火箭電泳、雙向免疫電泳、瓊脂免疫電泳。（1）對流免疫電泳這是一種將雙向擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合而成的方法。

原理：抗原與抗體分別置于凝膠板電場負(fù)、正極附近的小孔中，通電后，抗原向正極移動，而抗體則向負(fù)極移動，結(jié)果在兩孔間合適的抗原、抗體濃度處會形成一條沉淀線。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和甲種胎兒蛋白(AFP)等的檢測。第39頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、免疫電泳（2）火箭免疫電泳定義：抗原在含定量抗體的瓊脂中向一個方向泳動，兩者比例合適時，在較短時間內(nèi)生成如火箭狀或錐狀的沉淀線。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。圖7-6火箭電泳結(jié)果示意圖第40頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）雙向免疫電泳這是一種將火箭電泳與血清免疫電泳相結(jié)合的方法定義：先將血清用電泳分離出各成分，然后切下凝膠板轉(zhuǎn)移至另一已加有抗血清的凝膠上，進(jìn)入垂直方向的第二次電泳，形成呈連續(xù)火箭樣的沉淀線。

圖7-7雙向免疫電泳示意圖

第41頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月3、免疫電泳（4）瓊脂免疫電泳先進(jìn)行瓊脂平板電泳再做雙向瓊脂擴(kuò)散的血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。定義：先將抗原樣品在瓊脂凝膠中電泳，不同抗原成分因其遷移率的不同而分離成區(qū)帶，挖一條平行的抗體槽，加入抗血清做雙向擴(kuò)散，在兩者比例適合處形成可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，即可分析樣品中所含的抗原成分和含量。瓊脂免疫電泳示意圖第42頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(三)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)定義：有補(bǔ)體參與，并以綿羊紅血球和溶血素(紅細(xì)胞的特異抗體)是否發(fā)生溶血反應(yīng)作指示的一種高靈敏度的抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)。原理：補(bǔ)體沒有特異性，可與任何抗原抗體復(fù)合物發(fā)生結(jié)合(即不能與單獨(dú)的抗原或抗體結(jié)合)，一旦結(jié)合后并不再游離，但不能顯示肉眼可見現(xiàn)象。通常應(yīng)用溶血系統(tǒng)作為指示劑，以判定補(bǔ)體是否已被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合。游離補(bǔ)體，就會出現(xiàn)肉眼可見的溶血反應(yīng)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)有抗原、抗體、補(bǔ)體、紅血球、溶血素5種成分參加，并分屬于反應(yīng)系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。第43頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

圖7-9補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意圖

第44頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月4、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（1）反應(yīng)系統(tǒng)(試驗(yàn)系統(tǒng)、結(jié)合系統(tǒng))

由已知抗原(或抗體)、被檢抗體(或抗原)和補(bǔ)體組成。先加入抗原、抗體，再加入補(bǔ)體，混合后作用一定時間。如果抗原和抗體相對應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，則補(bǔ)體就被結(jié)合，否則即為游離狀態(tài)。（2）指示系統(tǒng)(溶血系統(tǒng))由紅血球(抗原)和溶血素(抗體)組成。在反應(yīng)系統(tǒng)完畢后，再向試管內(nèi)加入綿羊紅血球和溶血素。不發(fā)生溶血：補(bǔ)體被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，陽性反應(yīng)。發(fā)生溶血：液體中的抗原抗體不相對應(yīng)，沒有發(fā)生結(jié)合，補(bǔ)體依然游離存在，反應(yīng)陰性。第45頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月三、免疫標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)包括免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫定位分析、免疫親和層析和免疫生物傳感器技術(shù)等，其中尤以免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展最快，應(yīng)用最廣。免疫標(biāo)記技術(shù)：將某些小分子物質(zhì)作為標(biāo)記劑（如熒光素、酶、放射性同位素或電子致密物質(zhì)等）結(jié)合到抗原或抗體上，不抗原抗體反應(yīng)，更容易觀察，提高檢測的靈敏度。標(biāo)記劑：與抗原或抗體結(jié)合的小分子物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，反應(yīng)速度快，容易觀察；既可用于定性、定量分析，又可用于分子定位等工作

第46頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月現(xiàn)代免疫技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)1、免疫熒光技術(shù)2、免疫酶技術(shù)3、放射免疫測定法4、免疫電鏡技術(shù)第47頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月定義：一種將結(jié)合有熒光素的熒光抗體與抗原反應(yīng)，以提高免疫反應(yīng)靈敏度和適合顯微鏡觀察的免疫標(biāo)記技術(shù)。熒光素濃度在10-8時，仍可受激發(fā)而射出肉眼可見的熒光。原理：在一定條件下以化學(xué)方法將熒光素與抗體結(jié)合，制成熒光素抗體，但不影響抗體的免疫活性。如果標(biāo)本中的抗原與熒光素抗體結(jié)合著染后，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見物體，即可達(dá)到檢出抗原的目的。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(RB200)，在藍(lán)紫光激發(fā)下，分別發(fā)出鮮明的綠色熒光和橙黃色熒光?；痉椒ǎ褐苯臃ǎg接法、補(bǔ)體結(jié)合法和標(biāo)記法。(一)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）第48頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(一)、免疫熒光技術(shù)（熒光抗體法）（1）直接法（2）間接法（3）補(bǔ)體結(jié)合法（4）標(biāo)記法圖7-10免疫熒光抗體法原理示意圖第49頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月直接免疫熒光法第50頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月間接接免疫熒光法第51頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月

免疫熒光技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的血清學(xué)檢驗(yàn)方法。一種酶作標(biāo)記的抗體或抗抗體的高靈敏度的免疫標(biāo)記技術(shù)。原理：利用酶與抗原或抗體結(jié)合后，既不改變抗原或抗體的疫學(xué)反應(yīng)特異性，也不影響酶本身的活性，在特異抗原抗體反應(yīng)后，于相應(yīng)而合適的酶底物作用下，產(chǎn)生可見的不溶性有色產(chǎn)物。與免疫熒光技術(shù)區(qū)別：有色的沉淀物可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞水平的抗原追蹤，也可在電子顯微鏡下進(jìn)行分子水平的觀察，又能用分光光度計定量測定酶作用底物分解的量。(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）目前常用辣根過氧化物酶(HRP)，也有用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體第52頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）1.酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA，酶標(biāo)法)ELISA是目前應(yīng)用最廣泛的生物學(xué)技術(shù)之一。原理：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。ELISA試驗(yàn)中需要有3種試劑：①固相的抗原或抗體。目前多用聚苯乙烯酶標(biāo)板(微量滴定板)作為固相載體②酶標(biāo)記的抗原或抗體。③酶作用的底物。第53頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原捕獲ELISA第54頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1、把抗體固定在固相支持物上（96孔板）；2、加入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白；3、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一個供檢測用的酶（辣根過氧化物酶）4、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測定。第55頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月第56頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月ELISAforHIVantibody

MicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity第57頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月(二)、免疫酶技術(shù)（酶免疫測定技術(shù)）1.酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高，特異性強(qiáng)。②酶標(biāo)抗體制備容易，且高度穩(wěn)定而有效期長。③操作簡便④應(yīng)用范圍廣泛。

ELISA技術(shù)用于檢測多種病原菌抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。在食品加工領(lǐng)域，ELISA技術(shù)可用于測定蛋白質(zhì)，也可用于測定各種生物活性成分，如異黃酮半抗原。在食品安全方面，用于檢測食品中農(nóng)藥殘留，以及檢測食品中的病原菌及其毒素，如沙門氏菌及其內(nèi)毒素和腸毒素、大腸桿菌及其腸毒素和腸細(xì)胞出血毒素、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、霉菌和真菌毒素。第58頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1.酶聯(lián)免疫吸附法ELISA方法：將可溶性抗體或抗原吸附到聚苯乙烯等固相載體上，再滴加酶標(biāo)記的抗原或抗體，然后添加底物，進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測定。①雙抗體夾心法本法用于檢測抗原。圖7-11雙抗體夾心法測抗原示意圖

標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗體

底物

固相抗體第59頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1.酶聯(lián)免疫吸附法②間接法

圖7-11間接法測抗原示意圖

標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗體

底物

固相抗原第60頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1.酶聯(lián)免疫吸附法③斑點(diǎn)酶免疫吸附法(dot-ELISA)本法原理與上述兩法相同，方法上的不同之處是：A用硝酸纖維薄膜取代上述微量滴定板；B最終顯色反應(yīng)是不溶于水的有色沉淀物，例如，堿性磷酸酶的底物不能用對硝基酚磷酸鹽，而要用氮藍(lán)四唑(NBT)等。最終可從薄膜上沉淀物顏色的有無或多少確定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高(比普通ELISA高10～100倍)，與放射免疫測定相當(dāng)。第61頁，課件共66頁，創(chuàng)作于2023年2月1.酶聯(lián)免疫吸附法④生物素-親和素系統(tǒng)（BAS)在ELISA中的應(yīng)用

親和素是存在于蛋清中的堿性糖蛋白，一個親和素分子由4個亞基組成，可與4個生物素分子穩(wěn)定結(jié)合；生物素是存在于蛋黃中的維生素