醫(yī)學遺傳學表觀遺傳學

醫(yī)學遺傳學表觀遺傳學第1頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月表觀遺傳學(epigenetic)：DNA的序列不發(fā)生變化、基因表達改變、并且這種改變可穩(wěn)定遺傳。表觀遺傳學研究的內容：

基因選擇性轉錄、表達的調控?；蜣D錄后調控。第2頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月表觀遺傳修飾從多個水平上調控基因表達：

DNA水平：DNA甲基化蛋白質水平：組蛋白修飾染色質水平：染色質重塑RNA水平：miRNA、RNA干擾第3頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月表觀遺傳學的研究意義：表觀遺傳學補充了“中心法則”所忽略的兩個問題，即哪些因素決定了基因的正常轉錄和翻譯以及核酸并不是存儲遺傳信息的唯一載體。表觀遺傳信息可以通過控制基因的表達時間、空間和方式來調控各種生理反應。所以許多用DNA序列不能解釋的現象都能夠找到答案。與DNA序列的改變不同，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這使表觀遺傳疾病的治愈成為可能。第4頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)表觀遺傳修飾1、DNA甲基化(DNAmethylation)DNA甲基化是目前研究得最清楚、也是最重要的表觀遺傳修飾形式。通過甲基供體——S-腺苷甲硫氨酸，并在DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)的催化下，CpG二核苷酸中的胞嘧啶環(huán)上5’位置的氫被活性甲基所取代，從而轉變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。第5頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月胞嘧啶甲基化反應第6頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月

DNA復制酶CH3CH3CH3CH3DNA甲基轉移酶CH3CH3CH3CH3DNA復制后甲基化型的維持第7頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月CpG島（CpGisland）第8頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化抑制基因的表達第9頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化→基因沉默(genesilence)非甲基化(non-methylation)→基因活化(geneactivation)去甲基化(demethylation)→沉默基因的重新激活（reactivation）第10頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA高甲基化：基因啟動子區(qū)的CpG島在正常狀態(tài)下一般是非甲基化的，當發(fā)生甲基化時，基因轉錄沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修復基因等喪失功能，從而導致正常細胞的生長分化調控失常以及DNA損傷不能被及時修復，這與多種腫瘤形成密切相關。第11頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA低甲基化：整個基因組普遍低甲基化，這種廣泛的低甲基化會造成基因的不穩(wěn)定，這與多種腫瘤的發(fā)生有關。DNA的低甲基化也可能在異常組蛋白修飾的協同下引起某些T細胞基因的異?；罨?、導致自身免疫性疾病的發(fā)生。第12頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白修飾DNA以染色質的形式存在，染色質通常由DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量RNA包裝而成，其中組蛋白是染色質的基本結構蛋白。組蛋白的N-末端可通過共價作用從而發(fā)生乙?；⒓谆⒎核鼗约傲姿峄确g后的修飾，這些修飾的信息構成了豐富的組蛋白密碼，其中乙?；图谆亲顬橹匾男揎椃绞?。第13頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白的不同修飾第14頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白乙?；航M蛋白乙酰化是由組蛋白乙?；D移酶(HAT)和組蛋白去乙酰基酶(HDAC)協調催化完成，修飾的部位一般位于N-末端保守的賴氨酸殘基上。組蛋白乙酰化是一個可逆的動力學過程，可以調節(jié)基因的轉錄。第15頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白甲基化：組蛋白甲基化多發(fā)生于組蛋白H3、H4的賴氨酸和精氨酸殘基上，由特異的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histonemethyltransferase,HMT)催化完成，也是一個可調控的動態(tài)修飾過程。而組蛋白的去甲基化是由賴氨酸去甲基酶(lysine-specificdemethylase1,LSD1)催化完成。第16頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白的其他修飾：組蛋白泛素化由E1、E2、E3級聯酶催化修飾，也是一個可逆的動力學過程。所有組蛋白的組分均能磷酸化。組蛋白的各種修飾不是相互獨立的，而是互相聯系的，例如H3-Serl0的磷酸化可以促進H3-K14乙?；鳫3-K9的甲基化則會阻止H3-Serl0的磷酸化。第17頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月染色質重塑染色質重塑染色質重塑染色質重塑(remodeling)染色質重塑是指染色質位置、結構的變化，主要包括緊縮的染色質在核小體連接處發(fā)生松動造成染色質的解壓縮，從而暴露了基因轉錄啟動子區(qū)中的順式作用元件，為反式作用因子的結合提供了可能。第18頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月染色質重塑與基因轉錄第19頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月動態(tài)的染色質重塑過程是大多數以DNA為模板的生物學過程的基礎，如基因的轉錄、DNA的復制與修復等等，而這些生物學過程的混亂都與疾病的發(fā)生、發(fā)展直接相關，因此染色質重塑不僅能夠調節(jié)基因的轉錄，同時還參與了與疾病發(fā)生密切相關的那些基礎細胞生理過程。但是不同的染色質重塑能夠導致不同的疾病，又提示我們這些生理過程并不是獨立的起作用。第20頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月非編碼RNA調控(ncRNA)功能性非編碼RNA在表觀遺傳修飾中發(fā)揮極其重要的作用。ncRNA按照大小可分為兩類：長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。長鏈非編碼RNA在基因簇乃至于整個染色體水平上發(fā)揮順式調節(jié)作用，短鏈RNA在基因組水平對基因的表達進行調控。第21頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月長鏈非編碼RNAX染色體的失活就是長鏈ncRNA所介導的甲基化和組蛋白修飾共同參與的一個復雜的過程。x染色體上的失活基因編碼出相應RNA，這些RNA包裹在x染色體上，達到某一水平后，在甲基化和組蛋白修飾的參與下共同導致并維持x染色體的失活。此外長鏈ncRNA常在基因組中建立單等位基因表達模式，在核糖核蛋白復合物中充當催化中心，對染色質結構的改變發(fā)揮著重要的作用。第22頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月短鏈非編碼RNA短鏈非編碼RNA(又稱小RNA)能夠介導mRNA的降解，誘導染色質結構的改變，決定著細胞的分化命運，還對外源的核酸序列有降解作用以保護本身的基因組。短鏈非編碼RNA的表達與功能第23頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA干擾(RNAInterference,RNAi)真核生物mRNA編碼區(qū)同源的外源雙鏈RNA(DoubleStrandRNA,dsRNA)能特異地誘導其同源mRNA的降解，導致相應基因的沉默，這一現象被稱為RNA干擾，RNAi依賴于小干擾RNA(SmallInterferenceRNA,siRNA)與靶序列之間嚴格的堿基配對，具有很強的特異性。第24頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月miRNA真核生物體內另一類重要的非編碼RNA就是miRNA。miRNA是一類長約為21~23nt的單鏈RNA分子，廣泛存在于從植物、線蟲到人類的細胞中。miRNA的生成與功能第25頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月不同表觀遺傳學修飾之間的相互調控表觀遺傳修飾從多個水平上調控基因表達，而不同水平的調控之間也是相互關聯的，任何一方面的異常都可能影響到其他水平的表觀遺傳修飾。事實上不同水平的表觀遺傳修飾在真核細胞中構成了一個完整的表觀遺傳調控網絡。第26頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月最初認為不同腫瘤細胞中的miRNA的表達異常是缺失或者突變的結果，但是一些最新研究顯示miRNA的表達也會受到甲基化和其他表觀遺傳機制的影響。miRNA的表達受甲基化和其他表觀遺傳機制的調控siRNA誘導DNA的甲基化siRNA誘導的轉錄水平基因沉默是通過指導基因組表觀修飾完成的，包括指導基因組DNA甲基化和指導組蛋白修飾，siRNA指導的DNA甲基化具有精確特定的靶向性，在某種程度上與腫瘤細胞中抑癌基因特定沉默過程有關。第27頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)表觀遺傳疾病DNA甲基化與疾病DNA甲基化與腫瘤腫瘤細胞中的DNA甲基化一般表現為總體的低甲基化水平和特定區(qū)域的高甲基化，這些變化可以同時發(fā)生在同一腫瘤組織內?；蚩傮w甲基化水平降低導致染色體不穩(wěn)定、DNA修復基因、細胞周期調控基因、細胞凋亡基因相應的CpG島的甲基化沉默，進而促進了腫瘤細胞的形成。第28頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月腫瘤類型表觀遺傳修飾改變肺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（p16INK4a、DAPK1、RASSF1A）、CBP基因組及染色體重組因子BRG1的缺失乳腺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（BRCA1、E-cadherin、TMS1、雌激素受體）食管癌組蛋白去甲基基因JMJD2C/GASC1擴增、CpG島高甲基化（p16INK4a、p14ARF）胃癌CpG島高甲基化（hMLH1、E-cadherin、p14ARF、p16INK4a）肝癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（SOCS1、GSTP1、）、癌基因的低甲基化（c-fos、c-jun、c-myc）結直腸癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（hMLH1、p16INK4a、RARB2、SFRP1、WRN）、miRNA高甲基化、IGF2印記作用丟失、組蛋白修飾突變（EP300和HDAC2）、單乙酰化和組蛋白H4環(huán)丙烷形式的降低腎癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（VHL）、IGF2印記作用丟失膀胱癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（p16INK4a、TPEF/HPP1）、miRNA高甲基化前列腺癌基因組水平的低甲基化、CpG島高甲基化（GSTP1）、組蛋白甲基轉移酶EZH2基因擴增；組蛋白H3和H4異常修飾、癌基因的低甲基化（k-ras）卵巢癌CpG島高甲基化（BRCA1）、微衛(wèi)星DNA低甲基化神經膠質瘤CpG島高甲基化（MGMT、EMP3和THBS1）淋巴瘤CpG島高甲基化（p16INK4a、p73和MGMT）、單乙酰化和組蛋白H4環(huán)丙烷形式的降低白血病CpG島高甲基化（p16INK4a、p15INK4b、EXT1和ID4、E-eadherin）、組蛋白修飾易位（CBP、MOZ、MORF、MLL1、MLL3和NSD1）不同腫瘤中表觀遺傳學修飾的異常變化第29頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月原癌基因(oncogene)：較低水平的原癌基因對于細胞的生長、發(fā)育、分化和信號傳導都是必需的，當發(fā)生突變或基因異常表達時癌癥就產生了。研究發(fā)現原癌基因通常在腫瘤新生物中呈現低甲基化狀態(tài)。腫瘤抑制基因(tumorsuppressiongene)：腫瘤抑制基因的產物能夠抑制細胞的生長，失去其功能將促進細胞的轉化；與原癌基因在激活方式上的不同在于腫瘤抑制基因的激活必須有等位基因的兩次突變或缺失。藥物：葉酸和維生素B12都是甲基的供體，能影響甲基化的狀態(tài)，主要是對全基因組甲基化上調的影響。環(huán)境因素：環(huán)境因素亦可影響腫瘤中基因的甲基化，從而間接的促進或影響腫瘤的發(fā)生。第30頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化與自身免疫性疾病DNA甲基化的改變可以影響一些與黏附分子和細胞因子表達相關的基因，導致T細胞的自身反應性改變，因此對維持T細胞的功能至關重要。研究證實，沒有維持DNA甲基化水平和模式的成熟T細胞，在體內、外均能發(fā)生自身反應性，因此表觀遺傳的失控可以引起自身免疫性疾病。第31頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化與衰老DNA甲基化作為哺乳動物細胞基因組修飾和表達調控的后遺傳方式，在細胞的衰老過程中總體水平下降，同時又伴隨著某些基因的高甲基化。永生化細胞基因組的甲基化水平較高，因此甲基化水平過高又是腫瘤細胞的表現。目前年齡相關的甲基化已作為細胞生命歷史的標簽。第32頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化與心血管疾病心血管疾病被認為是受甲基化控制的人類重要疾病，對心血管疾病的DNA甲基化調控機制深入研究，有利于制定心血管疾病的有效防御策略，同時DNA甲基化的可逆性，為采用控制飲食及其他環(huán)境手段干預心血管疾病的進程提供了新的方法。第33頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化與精神疾病1972年Gottesman就將外遺傳這一概念引入精神病遺傳學研究。近些年當傳統(tǒng)遺傳研究在精神疾病的研究中困難重重時，外遺傳與精神疾病尤其是DNA甲基化與精神分裂癥的關系，引起了研究者的重視。雖然目前還處于假說階段，但不少研究已提示DNA甲基化參與了精神分裂癥的發(fā)生。第34頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白修飾、染色質重塑與疾病染色質重塑復合物、組蛋白修飾酶的突變均與轉錄調控、DNA甲基化、DNA重組、細胞周期、DNA復制和修復的異常相關，這些異?？梢砸鹕L發(fā)育畸形，智力發(fā)育遲緩，甚至導致癌癥。第35頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月染色質重塑異常引發(fā)的疾病是由于重塑復合物中的關鍵蛋白突變導致染色質重塑失敗，即核小體不能正確定位，并使DNA損傷修復復合物，基礎轉錄裝置等不能接近DNA，影響基因的正常表達。如果突變導致抑癌基因或調節(jié)細胞周期的蛋白出現異常將導致癌癥的發(fā)生。乙?；傅耐蛔儗е抡；虿荒鼙磉_，去乙酰化酶或一些去乙?；赶嚓P蛋白的突變使去乙酰化酶錯誤募集將引發(fā)腫瘤等疾病。第36頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組印記與疾病基因組印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達特性，這種修飾常為DNA甲基化修飾，也包括組蛋白乙酰化、甲基化等修飾。第37頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月目前發(fā)現的印記基因大約80%成簇，這些成簇的基因被位于同一條鏈上的順式作用位點所調控，該位點被稱做印記中心(imprintingcenter,IC)。印記基因異常表達引發(fā)伴有復雜突變和表型缺陷的多種疾病，許多印記基因對胚胎和胎兒出生后的生長發(fā)育調節(jié)非常重要，對行為和大腦功能也有很大影響，印記基因的異常同樣可誘發(fā)癌癥。第38頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月X染色體失活與疾病女性有兩條X染色體，男性只有一條X染色體，為保持平衡，女性一條X染色體被永久失活——“劑量補償”效應。X染色體隨機失活是X失活中心(Xinactivationcenter,Xic)調控的。X染色體失活相關疾病多是由X染色體不對稱失活使攜帶有突變等位基因的X染色體在多數細胞中具有活性所致。第39頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月非編碼RNA與疾病ncRNA對細胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用，而它們在腫瘤發(fā)生過程中的作用機制正在逐漸被認識。其中miRNA能夠調控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應激反應相關基因的表達，而且它們的表達異常是人類惡性腫瘤的一個共同特征。第40頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月人們對于表觀遺傳過程的關注程度日益增強，以DNA甲基化和組蛋白修飾為靶向的治療方法也初露端倪；在表觀遺傳修飾分析技術發(fā)展的基礎之上，我們可以進一步了解表觀遺傳過程的機制并設計出針對這一過程的治療性干預手段。第四節(jié)表觀遺傳學研究技術第41頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA甲基化的檢測基因組整體水平的甲基化分析高效液相色譜柱相關方法高效液相色譜儀結構示意圖最明顯優(yōu)點在于,可用于高通量混合樣本的檢測，能明確顯示目的基因組整體甲基化的水平，缺點：不能定位具體的甲基化位點。第42頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月SssI甲基轉移酶法缺點：SssI甲基轉移酶不穩(wěn)定，結果不夠精確。氯乙醛法該法可以直接測定基因組整體的5mC水平，優(yōu)點：所使用的試劑價格低廉且穩(wěn)定性好，可以避免放射性污染，缺點：費時費力，且氯乙醛為有毒物質。第43頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月基因特異位點的甲基化分析甲基化敏感性限制性內切酶-PCR/Southern法該方法是一種經典的甲基化研究方法，優(yōu)點：可同時檢測基因組內多個位點。易解釋，成本低廉。缺點：由于CG不僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態(tài)時，該檢測方法的結果才有意義；樣本量大；存在酶消化不完全引起假陽性的問題；不適用于混合樣本。第44頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月直接測序法重亞硫酸鹽處理示意圖該方法可靠性和精確度均較高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但是需要大量的克隆測序，操作過程繁瑣且費用昂貴。第45頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化特異性的PCR法優(yōu)點：避免了使用限制性內切酶及相關問題；敏感性高，可用于石蠟包埋樣本。缺點：對引物設計的要求高，可靠的引物需設計包含兩或多個完全甲基化或非甲基化位點，限制了該方法的應用；只能作定性研究，不能作定量檢測；重亞硫酸鹽處理不完全導致結果假陽性。甲基化特異性的PCR示意圖第46頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法優(yōu)點：可以檢測特異位點甲基化情況且不受內切酶限制；通過設計不同的引物可在同一延伸反應中得到不同位點甲基化的情況；可檢測甲基化位點分布不均的樣本；能夠定量檢測甲基化水平；僅需少量的DNA，且可用于石蠟包埋樣本。缺點：實驗步驟略復雜，檢測多位點時需設計多個引物，不能對較長序列進行全面檢測；存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題。第47頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法優(yōu)點：相對簡單，不需預先知道位點及樣本序列；可進行定量研究；檢測所需的樣本量較少，可用于石蠟包埋樣本。缺點：只能獲得特殊酶切位點甲基化情況，因此陰性檢測結果不能排除樣品中甲基化存在的可能；由于限制性內切酶和PCR的使用，序列分析受到限制。第48頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化敏感性單鏈構象分析優(yōu)點：可用于等位基因甲基化分析；能提示甲基化狀態(tài)分布的不均性。缺點：只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而水平較低的不易分開，有時會因為甲基化位點的隨機和不均勻分布導致電泳條帶出現擁擠、拖尾的現象，故敏感性及準確性略低；檢測的片段不宜過長。第49頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳優(yōu)點：可以用來檢測出除最高溫度解鏈區(qū)域以外的所有發(fā)生甲基化的DNA片段，所需的樣品量少，能較直觀的顯示出甲基化情況。缺點：解鏈溫度和DGGE的變性濃度梯度需要摸索。第50頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化敏感性解鏈曲線分析最大的優(yōu)點：能夠對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析。缺點：不能夠精確檢測出甲基化的具體位點；研究序列的長度不宜過長；對低水平的DNA甲基化敏感性低。第51頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月Methylight優(yōu)點：高敏感、快速，非甲基化等位基因比例很高也能精確地檢測出甲基化的等位基因，可做多樣本、多位點分析，具備可重復性，所需的樣本量少，不需電泳分離，能夠為臨床樣本的研究提供可靠的技術支持。缺點：測定每個位點都要用一對引物和探針，費用高且受較多因素的影響。DNA微陣列法優(yōu)點：可用于多樣本、多位點甲基化的檢測，檢測所需的樣本量少，適于臨床樣本；缺點：不能得到每個位點的信息，探針可能存在交叉雜交致結果假陽性，因此該方法進行檢測時一定要設立對照。第52頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月甲基化敏感性斑點分析優(yōu)點：快速、簡便、易于掌握，能夠一次檢測多種樣本，包括石蠟包埋樣本。缺點：檢測序列不能過長；若探針錯誤雜交或重亞硫酸鹽處理不完全，則可能出現假陽性或假陰性結果。第53頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月MS-MLPA優(yōu)點：所需的樣本量少，由于探針具有非常短的識別序列，因此可以用于局部降解的DNA，如石蠟包埋的樣本；可用于分析大量的混合樣本，可一次檢測多個靶基因中位點的甲基化情況。缺點：探針連接位點受限制性內切酶位點識別的限制，且要考慮到所用酶的反應適宜溫度。第54頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月新甲基化位點的篩查限制性標記基因組掃描優(yōu)點：可一次得到多個位點甲基化的情況，利于新甲基化位點的尋找。缺點：RLGS圖譜不能完全確認缺失的片段是由于甲基化還是由于樣本本身缺失所致；對DNA質量要求高；結果復雜，不易解釋。MBD柱層法優(yōu)點：高通量，可對未知片段進行初篩，選出含有甲基化的片段進一步檢測，快速、簡便。缺點：DNA片段的特殊構型也可與MBD柱相結合，造成非特異性捕獲引起假陽性；是一種定性而非定量的方法；由于MBD柱中所含多肽的量不完全相同，因此不同的MBD柱或多次使用的MBD柱的結果可能存在差異。第55頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月COMPARE-MS該方法聯合運用了MBD柱層法及MS-RE法，避免了單用MBD時非特異性捕獲及單用內切酶時不完全消化所致的假陽性。在快速、簡便同時，保證了結果的特異性和敏感性。缺點：需要使用限制性內切酶，因此不同程度地受到內切酶識別位點的限制。第56頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月組蛋白修飾和染色質重塑的檢測染色質免疫沉淀技術染色質免疫沉淀技術(ChIP)是研究DNA與蛋白質相互作用的重要工具。它可以靈敏地檢測目標蛋白與特異DNA片段的結合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達的關系。根據“組蛋白密碼”學說，組蛋白的各種共價修飾的組合會以協同或拮抗的方式誘導特異的下游功能，因此染色質免疫沉淀技術也為研究組蛋白修飾在基因表達中的作用，全面闡明真核基因表達調控機制提供了強有力的工具。第57頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理：生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲破碎將染色質隨機切斷為一定長度范圍內的染色質片段，用所要研究的目的蛋白的特異性抗體沉淀交聯復合體，再經過蛋白質與DNA解除偶聯，最后純化目的片段并檢測。主要步驟：A.細胞固定；B.超聲破碎斷裂染色質；C.染色質的免疫沉淀；D.解除交聯和純化DNA；E.DNA的檢測。第58頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月染色質免疫沉淀結合芯片分析技術染色質免疫沉淀與芯片相結合技術(ChIP-on-chip)，成為研究目的蛋白質與全基因組中DNA相互作用位點的一種全基因組定位分析方法第59頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月基本原理：生理狀態(tài)下把細胞內的蛋白質和DNA交聯在一起，超聲波將其打碎為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過所要研究的目的蛋白質特異性抗體沉淀該復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，解交聯；用LM-PCR擴增富集的DNA片段并用熒光染料Cy5進行標記；未經免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR擴增，但用另一種染料Cy3標記擴增產物。然后，將兩組標記DNA與一張含有全基因組序列的DNA芯片進行雜交，從而大規(guī)模挖掘相關順式調控元件，高通量地篩選已知蛋白質的未知DNA靶點與反式作用因子在整個基因組上的分布情況。第60頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月全基因組定位技術全基因組定位技術(GMAT)是一種將染色質免疫沉淀和基因表達系列分析相結合的方法。它通過快速、詳細地分析成千上萬個EST來尋找表達豐度不同的SAGE標簽序列來獲得全基因組水平上的表達信息?；驹恚菏紫扔每鼓撤N修飾組蛋白尾端的抗體進行ChIP，獲得細胞中與這種修飾的組蛋白相結合的全部DNA片段；然后利用SAGE技術構建文庫并進行測序和生物信息學分析，從而獲得這種組蛋白在全基因組中分布狀況的信息。第61頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月非變性染色質免疫沉淀技術非變性染色質免疫沉淀技術(nChIP)利用微球菌核酸酶把染色質消化成碎片，使用相應的抗體將含有蛋白或者修飾后蛋白的染色質片斷進行免疫選擇。nChIP分為三個階段：染色質制備；免疫沉淀；DNA和蛋白質的分析。第62頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月nChIP主要具有三個方面的優(yōu)點：可以通過蔗糖梯度純化微球菌核酸酶處理所得到的單個核小體作為實驗所需的染色質，從而做到單核小體水平上的高分辨率定位；免疫沉淀所得到的蛋白質復合物可以直接通過考馬斯亮藍染色的聚丙烯酰胺電泳檢測免疫沉淀的效率，沒有甲醛交聯這一步，可以在不改變蛋白質電荷的情況下恢復其狀態(tài)，因而適于用酸-尿素-Triton膠來檢測多方面的數據；nChIP實驗染色質準備階段中所丟失的蛋白質可能有助于對附著有轉錄因子的修飾后核小體的研究。第63頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月染色質的構型研究DNaseⅠ高敏感性分析局部能轉錄的DNA形成能夠結合DNaseⅠ的構象的特性，是的DNaseⅠ高敏性實驗的基礎。染色質構象捕獲(3C)交聯DNA片段之間的連接條件要遠遠優(yōu)于隨機片段，故通過PCR可定量分析兩特定限制片段的交聯頻率，或兩個基因位點相互作用的頻率。三維熒光原位雜交技術高分辨率的三維熒光原位雜交技術(3DFISH)實現了染色體組空間結構和核內不同染色質區(qū)的分析。第64頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月miRNA的檢測與功能分析miRNA基因鑒定miRNA具有獨特的結構和生物特性：成熟miRNA長度為21~23nt左右，可以利用RNA雜交分析或其它的實驗方法進行鑒定，比如從小RNA文庫直接克隆得到；miRNA前體具有發(fā)夾或折疊的二級結構，不含大的內部環(huán)狀結構和突起，且成熟的miRNA應位于發(fā)夾結構的頸部；成熟的miRNA由Dicer加工而成，伴隨Dicer功能活性的減少，可以檢測到生物體中前體的積聚；成熟miRNA的序列和預測的發(fā)夾結構在不同物種間是保守的。第65頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月迄今為止，miRNA獲取的方法主要包括兩種：直接從總RNA中克隆出小RNA，再根據生物信息學方法排除不符合miRNA結構的小RNA；以結構特征為基準，利用計算機輔助篩選法選出miRNA候選基因，再通過實驗加以驗證。第66頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月正向、反向遺傳學分析方法正向遺傳學分析方法的原理是：把突變的基因從產生非正常表型的生物體或者組織當中分離出來，進行研究鑒定。反向遺傳學分析方法的原理是：在體外引入特定的突變，例如定位誘變法，然后把已突變的基因放回到原來的宿主當中，而且常常是通過同型基因化或換位放回到宿主中原來的位置上，從而觀察表型的改變。第67頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組實驗方法該方法鑒定miRNA基因需要制備小RNA的cDNA文庫。計算機預測法主要依據：首先，發(fā)夾結構是miRNA二級結構的基本特性，所有的預測法都需要考慮這一原則；其次，是依據miRNA序列和結構的保守性，這是區(qū)分miRNA候選基因和其它不相關發(fā)夾結構序列關鍵因素；最后，根據發(fā)夾結構的動力學穩(wěn)定性和序列、結構的相似性，或者利用相關已知miRNA的遺傳座位進行預測新的miRNA。第68頁，課件共75頁，創(chuàng)作于2023年2月miRNA靶標的鑒定miRNA靶標鑒定高效性影響因素第一，在動物中miRNA與靶基因mRNA以不精確的堿基互補配對結合于3’UTR。第二，miRNA是序列短小的小分子，與3’UTR結合的方式存在多樣性。另外，結合位點除了配對區(qū)還存在突環(huán)和錯配區(qū)，這也給分析軟件準確性帶來障礙。第三，理論上預測出的靶標假陽性現象比較嚴重。第四，在進化過程