基因工程第四章目的基因的分離和合成

基因工程第四章目的基因的分離和合成第1頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第四章目的基因的分離與合成獲得目的基因的方法：限制酶直接分離從基因組文庫中篩選逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA或從cDNA文庫中篩選人工合成PCR擴(kuò)增基因改造

第2頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第四章目的基因的分離與合成第一節(jié)限制酶直接分離一、用于一些物理圖譜已確定的、背景資料比較清晰的原核生物基因的制備對(duì)已定序列的DNA分子只需用已知識(shí)別序列的限制酶進(jìn)行一次或幾次的切割，分離純化所需的DNA片斷，與適當(dāng)?shù)妮d體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆。對(duì)已知定位的目的基因只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知酶切位點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)拿盖懈睿淮渭纯色@得目的基因。第3頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第一節(jié)限制酶直接分離二、用于一些物理圖譜未確定的、背景資料不明的原核生物基因的制備采用鳥槍法（shotgun）：從細(xì)菌細(xì)胞中分離細(xì)菌染色體用機(jī)械切割或限制酶分解得到各種大小的基因片段用相同的限制酶酶切載體質(zhì)粒，與染色體片斷連接輸入到受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化子的選擇第4頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）第5頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10鳥槍法操作的改進(jìn)

使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

第6頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10鳥槍法操作的改進(jìn)例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離

2.0kb1.6kb1.8kb第7頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第8頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的基本概念基因庫（genepool）

特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）

從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）

存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：

cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）

第二節(jié)建立基因組文庫第9頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫第二節(jié)建立基因組文庫第10頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

例如，人的單倍體DNA總長(zhǎng)為2.9x109bp，基因文庫中克隆片段的平均大小為15kb，則構(gòu)建一個(gè)完備性為0.9的基因文庫至少需要45萬個(gè)克?。欢?dāng)完備性提高到0.9999時(shí)，基因文庫至少需要180萬個(gè)克隆第二節(jié)建立基因組文庫第11頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的基本概念基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選第12頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長(zhǎng)度一般在100kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段第13頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的構(gòu)建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對(duì)堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體！第14頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10基因文庫的構(gòu)建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質(zhì)?？妓官|(zhì)粒10kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第15頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟1、利用λ噬菌體獲得目的基因的DNA片斷基因組DNA片段化的方法物理學(xué)方法：機(jī)械力和超聲波生物化學(xué)方法：限制酶（四個(gè)核甘酸序列識(shí)別位點(diǎn)的酶）與噬菌體克隆載體重組，體外包裝成噬菌體顆粒轉(zhuǎn)染宿主菌篩選培養(yǎng)第16頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟2、利用Cosmid基本與用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫相似。有如下不同：制備基因組DNA須特別小心必須保證DNA分子盡可能大載體的處理比較簡(jiǎn)單連接重組時(shí)，cosmid的量要比插入片段的量高10倍以上包裝轉(zhuǎn)染后在平板上出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化菌落，不是嗜菌斑第17頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第二節(jié)建立基因組文庫三、建立基因組文庫的主要步驟3、利用YAC選用限制酶EcoRI和BamHI對(duì)pYAC4載體作雙酶消化選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽渖矬w完整的染色體DNA，并將其片段化收集純化大片段DNA，并與YAC臂連接轉(zhuǎn)化去壁酵母細(xì)胞，利用存在于兩臂上的選擇標(biāo)記，篩選含有YAC兩臂的酵母細(xì)胞第18頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第三節(jié)cDNA基因文庫的構(gòu)建一、cDNA基因文庫的概念某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA基因文庫cDNA序列只與基因的編碼序列有關(guān)，不能反映基因的內(nèi)含子，也不能反映基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、終止子等非轉(zhuǎn)錄序列cDNA基因文庫可分為表達(dá)型和非表達(dá)型表達(dá)型cDNA文庫的構(gòu)建：λgt11非表達(dá)型cDNA文庫的構(gòu)建：λgt10第19頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10第三節(jié)cDNA基因文庫的構(gòu)建二、cDNA基因文庫的構(gòu)建細(xì)胞總RNA的制備及mRNA的分離cDNA第一條鏈的合成雙鏈cDNA的合成cDNA與載體的連接，重組到相應(yīng)的載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞增值第20頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建細(xì)胞總RNA的制備及mRNA的分離總RNA：mRNA、tRNA、rRNAmRNA的分離純化利用真核生物mRNA其3‘末端的poly（A）尾巴與oligo（dT）配對(duì)特性，制備oligo（dT）型纖維素親和層析柱第21頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建以mRNA分子為模板，合成cDNA分子第一鏈Oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成法隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法第22頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA分子的合成自我引導(dǎo)合成法堿處理mRNA-cDNA雜交分子，降解mRNA單鏈cDNA在3‘端易發(fā)生自身環(huán)化形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)為cDNA第二鏈的合成提供引物在klenow酶的作用下合成cDNA第二鏈用S1酶切割除去單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)第23頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA分子的合成置換合成法RNA酶H和E.coliDNA聚合酶I混合處理mRNA-cDNA雜交分子，RNA酶H在雜合雙鏈mRNA鏈上產(chǎn)生缺口并形成部分cDNA單鏈區(qū)DNA聚合酶I以殘存的mRNA作為引物合成cDNA第二鏈T4-DNA連接酶修復(fù)缺口第24頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA分子的合成引物合成法在第一鏈合成完畢后，變性殘留的mRNA，用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA游離的3‘羥基端添加同聚物（dC）末端將其與人工合成的oligo-dG退火，形成引物結(jié)構(gòu)在klenow酶的作用下，合成第二條cDNA鏈。PCR法第25頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收第26頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10二、cDNA基因文庫的構(gòu)建雙鏈cDNA克隆的篩選探針原位雜交法差示雜交法第27頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因

第28頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10三、PCR擴(kuò)增法PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理第29頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10四、基因的化學(xué)合成DNA的化學(xué)DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法人工合成組成一個(gè)完整基因的所有寡核甘酸片段，相鄰的片段間有4-6個(gè)堿基的重疊互補(bǔ)相互互補(bǔ)的寡核甘酸片段復(fù)性，形成雙鏈寡核甘酸片段用T4連接酶連接酶促填充法第30頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10四、基因的化學(xué)合成DNA的化學(xué)DNA合成儀酶促法全片段酶促連接法酶促填充法合成目的基因其中的一些片段，在這些相鄰的片段的3‘端有一短的序列互補(bǔ)復(fù)性形成模板用klenow酶去填補(bǔ)互補(bǔ)片段間的單鏈區(qū)域第31頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為95%則合成50個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第32頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測(cè)為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡(jiǎn)并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮下列問題：生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應(yīng)具有足夠的長(zhǎng)度，通常在17-20個(gè)核苷酸之間探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域第33頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10化學(xué)合成的單元操作

化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。從反應(yīng)機(jī)理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的第34頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設(shè)計(jì)新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

第35頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10目的基因的分離目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因基本過程：分離特異蛋白，測(cè)定特異蛋白的氨基酸順序，推測(cè)該蛋白的核苷酸序列，合成探針分離特異蛋白，作為抗原制備抗體，篩選cDNA表達(dá)文庫第36頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10目的基因的分離目的基因的功能克隆根據(jù)特異蛋白分離目的基因注意事項(xiàng)：合成的探針必須特異的識(shí)別目的基因，充分考慮遺傳密碼的簡(jiǎn)并性利用抗體篩選目的基因時(shí)，應(yīng)構(gòu)建cDNA的表達(dá)文庫第37頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10目的基因的分離目的基因的功能克隆功能互補(bǔ)法克隆基因利用被克隆的DNA片斷與寄主細(xì)胞的染色體DNA在功能上的互補(bǔ)性來進(jìn)行目的基因的直接分離酵母基因組酶切DNA片斷λ噬菌體載體營養(yǎng)缺陷型菌株＋基本培養(yǎng)基重組體第38頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10實(shí)例：基因組文庫DNA→轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞（leu2,Leu-）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因基因組文庫DNA→轉(zhuǎn)化E.coli（無纖維素酶活性）→轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在纖維素平板上形成水解圈→纖維素酶基因

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，可靠，是首選方法。獲得的基因一定是完整基因。

缺點(diǎn)：適用范圍較窄。

必備條件：外源基因不僅能在受體細(xì)胞表達(dá)，而且必須具備生物學(xué)活性。第39頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/101.遺傳互補(bǔ)法1)

原理當(dāng)把一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。i.營養(yǎng)缺陷型受體細(xì)胞+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在合成培養(yǎng)基上→原養(yǎng)型細(xì)胞生長(zhǎng)ii.受體細(xì)胞（無某種表型）+外源DNA→轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在特殊培養(yǎng)基上→具有新性狀細(xì)胞iii.雖然有些受體細(xì)胞也能產(chǎn)生某種酶活性，但當(dāng)轉(zhuǎn)入目的基因后，該細(xì)胞可過量產(chǎn)生此酶活性，這亦可用于基因篩選。如釀酒酵母的MFα基因就是如此篩選到的。第40頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/102)分離步驟分離基因組文庫重組DNA分子→轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主細(xì)胞→涂布在選擇培養(yǎng)基上→隨機(jī)挑選陽性克隆，分離重組DNA分子→再轉(zhuǎn)化相同受體細(xì)胞→高頻轉(zhuǎn)化子→基因的進(jìn)一步證實(shí)和鑒定

重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞SDS→出現(xiàn)新蛋白質(zhì)帶原載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞(一)分別制備無細(xì)胞抽提物酶活測(cè)定→酶活性出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞（二）免疫分析→與特定抗原反應(yīng)第41頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/102．核酸雜交法1)原理利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點(diǎn)分離目的基因（同源序列不是完全相同序列）優(yōu)點(diǎn)：不需要基因表達(dá)必備條件：合適的核酸探針或有關(guān)資料，外源DNA能在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增

2)核酸探針種類

i.DNA探針:分離自某一種生物ii.寡核苷酸探針:根據(jù)目的基因編碼蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列推測(cè)第42頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala六肽

QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN

對(duì)應(yīng)mRNAN：ACGT/U

CAN-AAP-GTP-CTP-CG探針序列Q：CT/UP：AG

32種14聚體混合物，其中必有一種14聚體與待測(cè)DNA完全互補(bǔ)*選擇的肽段中氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子應(yīng)最少。**這種探針最好用于目的cDNA分離。若用于分離基因，要事先考慮到此探針序列橫跨內(nèi)含子序列的可能。***此種探針亦可根據(jù)其他來源相同基因的保守序列設(shè)計(jì)。iii.cDNA探針:利用特異性mRNA反轉(zhuǎn)錄而成，亦可用不同mRNA混合物反轉(zhuǎn)錄而成iv.PCR探針v.RNA探針:由T3或T7啟動(dòng)子和相應(yīng)聚合酶轉(zhuǎn)錄其下游基因片段而得第43頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10

3)分離步驟

基因(基因組或cDNA)文庫→制備DNA樣品膜→與標(biāo)記探針雜交→雜交斑點(diǎn)（陽性克隆）→分離重組DNA分子→作斑點(diǎn)雜交陽性克隆Southern雜交以確認(rèn)雜交結(jié)果→DNA進(jìn)一步證實(shí)和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物3.免疫法1)原理

外源DNA引人宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此為抗原與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng),然后利用二抗與一抗反應(yīng)，用二抗偶聯(lián)的酶反應(yīng)篩選目的DNA第44頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10優(yōu)點(diǎn)：不依賴于基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,只要抗原決定序列能被正確表達(dá)。*外源DNA可以是一個(gè)完整編碼區(qū)，也可能是一個(gè)外顯子，這些序列可以插入E.coli表達(dá)型載體。必備條件：待分離基因的表達(dá)產(chǎn)物—蛋白質(zhì)必須純化和用于制備相應(yīng)抗體。2)

分離步驟基因文庫→蛋白質(zhì)樣品膜制備→免疫法篩選→有色斑點(diǎn)（陽性克隆）→進(jìn)一步證實(shí)：分離陽性克隆無細(xì)胞抽提物，作斑點(diǎn)印跡，western印跡免疫分析；分離重組DNA，檢測(cè)插入片段大小，測(cè)序等。第45頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10目的基因的分離目的基因的序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因用核酸探針進(jìn)行雜交篩選：根據(jù)已知序列合成相應(yīng)探針，再與基因組文庫的克隆進(jìn)行雜交，篩選陽性克隆，最后分離鑒定表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）法分離目的基因表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetagEST）:是指基因序列中一段能特異地標(biāo)記或表征基因的序列。第46頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10篩選目的基因片斷的差別雜交及減法雜交技術(shù)差別雜交（differentialhybridization）法應(yīng)用前提：需要擁有兩種不同的細(xì)胞群，即在一個(gè)細(xì)胞群中目的基因能正常生長(zhǎng)，而在另一細(xì)胞群中目的基因不表達(dá)。Fig4-21減法雜交（subtractivehybridization）技術(shù)mRNA減法雜交fig4-22基因組DNA減法雜交fig4-23第47頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10利用差示分析法分離目的基因克隆mRNA差別顯示技術(shù)（DD-PCR,DDRT-PCR）

fig4-24抑制性減法雜交（SSH）技術(shù)該法是一種用于分離和鑒定差異表達(dá)基因的革命性方法，特別適宜于那些差異表達(dá)量很低的基因，其富集效率在1000倍以上。待測(cè)ds-cDNA（testercDNA）和驅(qū)動(dòng)ds-cDNA（drivercDNA）fig4-26第48頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/10

4.染色體巡查法(chromosomewalking)1)原理

利用DNA探針篩選對(duì)應(yīng)重組DNA，然后以插入片段兩末端片段為探針選擇對(duì)應(yīng)重組DNA，此次篩選的DNA插入片段僅以一端為探針，繼續(xù)和重復(fù)該過程，直至篩選到目的基因優(yōu)點(diǎn)：可獲得染色體中一段DNA的限制酶圖譜，對(duì)基因組全序列測(cè)定十分有用缺點(diǎn)：工作量大，鑒定困難，當(dāng)巡查高等真核生物染色體時(shí)，重復(fù)DNA序列區(qū)域難以跨越。必要條件：兩基因間距離應(yīng)清楚。*該法的兩大難點(diǎn)：限制酶圖制作和末端片段探針制備。前者可用改進(jìn)的載體，后者可用RNA聚合酶合成末端探針2)操作步驟第49頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/