序列分析軟件的使用方法

序列分析軟件的使用方法第1頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月DNAMAN是一種常用的核酸序列分析軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已成為一種普遍使用的DNA序列分析工具。

第2頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月打開DNAMAN，可以看到如下界面：

第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十個(gè)常用主菜單，第二欄為工具欄：第三欄為瀏覽器欄：在瀏覽器欄下方的工作區(qū)左側(cè)，可見Channel工具條，DNAMAN提供20個(gè)Channel，點(diǎn)擊Channel工具條上相應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的Channel。每個(gè)Channel可以裝入一個(gè)序列。將要分析的序列（DNA序列或氨基酸序列）放入Channel中可以節(jié)約存取序列時(shí)間，加快分析速度。第3頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月如何使用DNAMAN分析序列

1．將待分析序列裝入Channel通過FileOpen命令打開待分析序列文件，則打開的序列自動(dòng)裝入默認(rèn)Channel。通過Sequence/LoadSequence菜單的子菜單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入Channel。通過Sequence/CurrentSequence/AnalysisDefination命令打開一個(gè)對(duì)話框，通過此對(duì)話框可以設(shè)定序列的性質(zhì)（DNA或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段等參數(shù)。第5頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2．以不同形式顯示序列

通過Sequence//DisplaySequence命令打開對(duì)話框，根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的序列轉(zhuǎn)換形式。對(duì)話框選項(xiàng)說明如下：Sequence&Composition顯示序列和成分第6頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月2．以不同形式顯示序列ReverseComplementSequence顯示待分析序列的反向互補(bǔ)序列ReverseSequence顯示待分析序列的反向序列ComplementSequence顯示待分析序列的互補(bǔ)序列DoubleStrandedSequence顯示待分析序列的雙鏈序列RNASequence顯示待分析序列的對(duì)應(yīng)RNA序列第7頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月3．DNA序列的限制性酶切位點(diǎn)分析將待分析的序列裝入Channel，點(diǎn)擊要分析的Channel，然后通過Restriction/Analysis命令打開對(duì)話框，參數(shù)說明如下：Results分析結(jié)果顯示其中包括：Showsummary（顯示概要）Showsitesonsequence（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)）Drawrestrictionmap（顯示限制性酶切圖）Drawrestrictionpattern（顯示限制性酶切模式圖）

第8頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月3．DNA序列的限制性酶切位點(diǎn)分析Ignoreenzymeswithmorethan（忽略大于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)）Ignoreenzymeswithlessthan（忽略小于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)）TargetDNA（目標(biāo)DNA特性）Circular（環(huán)型DNA），dam/dcmmethylation（dam/dcm甲基化）allDNAinSequenceChannel（選擇此項(xiàng)，在SequenceChannel中的所有序列將被分析，如果選擇了Drawrestrictionpattern，那么當(dāng)所有的channel中共有兩條DNA時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分析，如果共有三個(gè)以上DNA時(shí)，則只能用一個(gè)酶分析。）第9頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下列對(duì)話框：參數(shù)說明如下：Enzyme代表（enzymedatafile），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕，出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，restrict.enz和dnamane.enz，如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文件名。其中restrict.enz數(shù)據(jù)文件包含180種限制酶，dnamane.enz數(shù)據(jù)文件包含2524種限制酶。選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則對(duì)應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。第10頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例如puc18multiplecloningsites），然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對(duì)話框：輸入要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。Cutter酶切識(shí)別序列長度；End酶切產(chǎn)生的末端，其中包括，Blunt（平頭末端），5’Overhang（5’突出粘性末端）,3’Overhang(3’突出粘性末端)，系統(tǒng)根據(jù)cutter和end的設(shè)定情況,在左邊酶列表中顯示符合條件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。第11頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月4．DNA序列比對(duì)分析

（DotMatrixComparision）要比較兩個(gè)序列，可以使用DNAMAN提供的序列比對(duì)工具DotMatrixComparision（點(diǎn)矩陣比較）通過Sequense/Dotmatrixcomparision命令打開比對(duì)界面，點(diǎn)擊對(duì)比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框：第12頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月參數(shù)說明如下：Sequencetype序列類型Sequence1參加比對(duì)的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng)說明如下：如果要比對(duì)的序列在Channel中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選擇相應(yīng)的Channel，則被選中的Channel中的序列作為參加比對(duì)的第一序列；也可以從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列，在File選擇框上點(diǎn)擊即可。通過Length選擇參加比對(duì)的序列片段。Sequence2參加比對(duì)的第二序列選擇框；選項(xiàng)說明同上ShowSequence選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)，將顯示同源性；第13頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月Annotations是否顯示注釋Comparision比對(duì)參數(shù)，其中Window代表Windowsize（單位比對(duì)長度），Mismatch代表Mismatchsize（單位比對(duì)長度中許可的錯(cuò)配值）要快速比對(duì)，需將此項(xiàng)設(shè)為0。Bothstran代表Bothstrand（雙鏈比對(duì)）選擇此項(xiàng)，是指用Sequence2中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和Sequence1比較。Sequence2正鏈與Sequence1比較結(jié)果用黑色點(diǎn)表示，Sequence2負(fù)鏈比對(duì)結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。

第14頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月Plotbox點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)，Position（起點(diǎn)坐標(biāo)）Width（寬度值）Height（高度值）Framesize（邊框線粗度值）Dotsize（點(diǎn)粗度值）Gridline（虛線框數(shù)）。參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。第15頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月5．序列同源性分析（1）兩序列同源性分析通過Sequence/TwoSequenceAlignment命令打開對(duì)話框，如下所示：參數(shù)說明如下：Alignmentmethod比對(duì)方法，通常可選Quick(快速比對(duì))或Smith&Waterman(最佳比對(duì))，當(dāng)選擇快速比對(duì)時(shí)，設(shè)置較小的k-tuple值，可以提高精確度，當(dāng)序列較長時(shí)，一般要設(shè)置較大的k-tuple值。k-tuple值可選范圍2—6；蛋白質(zhì)序列：k-tuple值可選范圍1—3。

第16頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）多序列同源性分析通過打開Sequence/MultipleSequenceAlignment命令打開對(duì)話框，參數(shù)說明如下：File從文件中選擇參加比對(duì)的序列Folder從文件夾中選擇參加比對(duì)的序列Channel從channel中選擇參加比對(duì)的序列Dbase從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對(duì)的序列Remove清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的序列名選擇）Clear清除全部序列

第17頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對(duì)話框：選擇其中一種方法，點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)下列對(duì)話框：如果在前一對(duì)話框選擇的是Fastalignment,則在此對(duì)話框中選擇Quickalignment,否則選擇Dynamicalignment即可。其它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對(duì)話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。

點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對(duì)話框中選擇不同的結(jié)果顯示特性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)：

可以通過這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例如Tree/homologytree命令）。顯示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（ProteinSecondaryStructure命令），繪制限制性酶切圖（RestrictionAnalysis命令）等。第18頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月6.PCR引物設(shè)計(jì)首先，將目標(biāo)DNA片段裝入Channel,并激活Channel。點(diǎn)擊主菜單欄中的Primer主菜單，出現(xiàn)下拉菜單，點(diǎn)擊DesignPCRPrimersforDNA命令，出現(xiàn)下列對(duì)話框：

參數(shù)說明如下：Primerlocationsontarget引物定位其中包括下列選項(xiàng)：Productsize（擴(kuò)增目的片段大?。㏒enseprimer(正向引物選擇區(qū))

Antisenseprimer(反向引物選擇區(qū))Primer引物特性包括Length(引物長度)，Tm值,GC含量等參數(shù)；Rejectprimer引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）第19頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月包括下列選項(xiàng)：3’dimer(可形成3’端自我互補(bǔ)的堿基數(shù))Hairpinstem(可形成發(fā)卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù))PolyN(多聚堿基)3’Uique(3’端嚴(yán)格配對(duì)堿基數(shù))Allmatches(引物互補(bǔ)配對(duì)百分?jǐn)?shù))Consentrations濃度設(shè)定ProductforhybridyzatPCR產(chǎn)物用于SouthernBlot探針雜交

第20頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月7．畫質(zhì)粒模式圖我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章，常常需要質(zhì)粒圖。DNAMAN提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足我們的需要。通過Restriction/Drawmap命令打開質(zhì)粒繪圖界面：

將鼠標(biāo)移動(dòng)到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成“I”時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出現(xiàn)如下菜單：菜單說明如下：Position當(dāng)前位置AddSite添加酶切位點(diǎn)AddElement添加要素AddText添加文字InsertFragment插入片斷CopyFragment復(fù)制片斷CutFragment剪切片斷RemoveFragment清除片斷FrameThickness邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié)

第21頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月點(diǎn)擊AddSite選項(xiàng)，出現(xiàn)對(duì)話框：參數(shù)說明如下：Name要添加的酶切位點(diǎn)的名稱(例如HindIII)Position位置（以堿基數(shù)表示）點(diǎn)擊AddElement選項(xiàng)，出現(xiàn)如下對(duì)話框：

參數(shù)說明如下：Type要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換）Color/Pattern填充色（共有16種顏色供選擇）Name要素名稱Start/End/Size要素起點(diǎn)/終點(diǎn)/粗細(xì)度

第22頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月核酸序列的一般分析流程

第23頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.1核酸序列的檢索

:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

1.2核酸序列的同源性分析1.2.1基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析

/blast/blast.cgi

1.2.2核酸序列的兩兩比較

/gorf/bl2.html

1.2.3核酸序列的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案)第24頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.3核酸序列的電子延伸

1.3.1利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸(方案)1.3.2利用Tigem的ESTMachine進(jìn)行電子延伸

ESTExtractor:http://gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html|

ESTAssembly:http://www.tigem/ESTmachine.html

1.3.3利用THC數(shù)據(jù)庫對(duì)核酸序列進(jìn)行電子延伸

http://gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html第25頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.4核酸序列的開放閱讀框架分析

1.4.1基于NCBI/ORFfinder的ORF分析

/gorf/gorf.html

1.5基因的電子表達(dá)譜分析1.5.1利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方案）1.5.2利用Tigem的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)譜分析

http://gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html第26頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.6核酸序列的電子基因定位分析

1.6.1利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位

/genome/sts/epcr.cgi

1.6.2利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位（方案）第27頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.7cDNA的基因組序列分析

1.7.1通過從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析(方案)

1.7.2通過從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析

/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&ORG=Hs

1.7.3通過從SangerCentre查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析

http://www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml

第28頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.8基因組序列的初步分析

1.8.1基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析

/urllists/genefind.htm

1.8.2基因組序列的啟動(dòng)子分析

/projects/promoter.html

第29頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月1.9核酸序列的注冊(cè)

1.9.1EST序列的注冊(cè)(方案)

1.9.2較長或全長cDNA序列的注冊(cè)(方案)1.10待分析序列所對(duì)應(yīng)的已知克隆的獲取

第30頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)引物引物的重要性引物設(shè)計(jì)的原則引物與PCR引物設(shè)計(jì)軟件如何使用PrimerPremier5.0引物同源性分析第31頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer第32頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物的重要性在整個(gè)PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。第33頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3’端引物5’端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)第34頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物長度一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過50個(gè)核苷酸。第35頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)GC含量一般40-60%GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。第36頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物Tm值一般要求：55℃-65℃。計(jì)算：對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對(duì)于較長引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15

第37頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物二聚體盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。第38頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。第39頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。第40頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性過去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C?，F(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。第41頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴(kuò)增第42頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在選擇引物時(shí)，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴(kuò)增區(qū)域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃Tmproduct=81.5+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/length第43頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L引物濃度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(單位：L)退火溫度最適退火溫度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。第44頁，課件共53頁，創(chuàng)作于2023年2月引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.