實驗一融合蛋白表達載體構(gòu)建的設(shè)計與質(zhì)粒提取與分析

實驗一融合蛋白表達載體構(gòu)建的設(shè)計與質(zhì)粒提取與分析第1頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月三、細胞轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化（CaCl2法，提前過夜搖菌）四、重組質(zhì)粒的鑒定（PCR法）提前轉(zhuǎn)板過夜PCR原理，反應(yīng)條件及PCR引物設(shè)計（軟件操作）重組轉(zhuǎn)化子的鑒定——PCR法（介紹Crackinggel等方法）重組轉(zhuǎn)化者的保存（-70℃）五、體外重組蛋白表達及分析提前IPTG誘導(dǎo)SDS膠Brandford蛋白定量分析蛋白純化及活性測定第2頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月六、總RNA的提取及測定組織總RNA的提取，變性膠鑒定講解RT-PCR七、基因組DNA的提取及鑒定基因組DNA的提取及鑒定基因組和cDNAPCR，基因結(jié)構(gòu)分析八、基因的蛋白水平表達檢測（Westernblot）Westernblot基因組DNA酶切膠檢測總復(fù)習(xí)，總結(jié)第3頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗一、融合蛋白表達載體構(gòu)建的設(shè)計與質(zhì)粒提取分析第一部分：分子實驗相關(guān)知識PartI：實驗課有關(guān)要求及注意事項PartII：分子生物學(xué)實驗有關(guān)基礎(chǔ)操作PartIII：基因克隆的原理PartIV：蛋白表達載體的構(gòu)建第二部分：質(zhì)粒DNA的提取及定量分析PartI：質(zhì)粒DNA提取的原理PartII：方法步驟PartIII：結(jié)果與分析第4頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月分子生物學(xué)實驗室一般安全知識

不能在實驗室吸煙，或吃喝東西。當使用危險或潛在危險物質(zhì)時，請穿上工作服，戴上手套，保護眼鏡和口罩。請記住，使用EB，酚等危險物質(zhì)時，必須戴手套，并且應(yīng)該經(jīng)常水洗手套的外圍，以免污染儀器等。當你離開實驗室時，務(wù)必脫掉手套方可離去。使用同位素及酚時，建議戴兩層手套。廢物的處理：廢液，強酸及強堿（須稀釋）等液體可以倒入水槽，并放水沖走。廢紙等固體廢物應(yīng)倒入垃圾桶。廢棄的微生物以及培養(yǎng)它們的朔料槍頭及管必須倒在指定桶內(nèi)以備消毒，培養(yǎng)基以及盛其容器必須高壓消毒后方可作普通物品處理。同位素實驗的廢液及物品，則分別倒在同位素室里指定的容器里。EB膠倒在指定桶內(nèi)。酚及氯仿及盛它們的管分別倒在化學(xué)通風(fēng)廚內(nèi)的容器內(nèi)。破碎的玻璃制品必須倒在特定的桶內(nèi)。第5頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月當你使用紫外分析儀時，應(yīng)戴上防紫外線的眼鏡。如果用它來切膠，請戴上面罩。同位素實驗必須在同位素室進行。不得隨意將同位素室里的任何儀器搬出來。完成同位素實驗后，必須用儀器測定所用物品，桌面及手套等，肯定沒有污染后方可離開同位素室。如果灑了化學(xué)，生物等危險物質(zhì)，把那區(qū)域作一記號，并馬上匯報老師，作相應(yīng)的處理。一般的藥品濺出，應(yīng)馬上用吸水紙清潔干凈。如化學(xué)物品濺到皮膚等，應(yīng)馬上用水沖洗。如輕微割傷并沒感染的話，可用紅十字藥盒里的止血貼，否則，馬上送醫(yī)院。任何事故應(yīng)馬上報告老師。第6頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月量程：0.5～10μl(讀數(shù)窗顯示0.5～10.0,精度為0.1μl)5～50μl(讀數(shù)窗顯示5.0～50.0,精度為0.5μl)20～200μl(讀數(shù)窗顯示20～200,精度為1μl)100～1000μl(讀數(shù)窗顯示100～1000,精度為5μl)第7頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月安裝吸頭使用量程配套的吸頭將槍嘴垂直插入吸頭盒的吸頭上輕輕用力向下壓，同時把手中的移液器按順時針方向旋轉(zhuǎn)180°，使吸頭緊緊地扣在槍嘴上。第8頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月移液操作一手拿住槍，另一手旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)來設(shè)置你所要的容量。把合適的槍頭插入槍的末端，并輕微旋轉(zhuǎn)一下。把活動桿壓下一檔。這讓槍定下你所要的容量。把槍頭直伸入液體約2-5mm深處。如果深入過深，

將使槍頭的外圍粘上液體而導(dǎo)致取液的誤差。讓活動桿慢慢地回到原始位置。否者，過快產(chǎn)生的

氣霧將污染槍管和你的溶液。讓槍頭在液中停一會，以便使液體完全進入槍頭。如果槍頭從液中移開太快，可能會有空氣在槍頭中。應(yīng)目測是否有氣泡或者所取的量是否符合你的要求。把槍頭貼在液面附近的管壁或管底，然后把液體放出。須檢查是否還有液體在槍頭中，如是，慢慢把液體放入管中。把槍頭去掉，扭回最大量程處。第9頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月移液操作tips

吸酶或母液時，永遠用新的干凈的槍頭。如果不幸污染了酶，請報告老師。即使是稀釋一梯度溶液，如要求很嚴格的體積，也必須使用新的頭。檢測是否漏氣的方法：將吸取液體后的移液器垂直靜置15秒，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象。嚴禁吸液后將移液器平放！對于粘稠液體可首先吸放幾次，然后極緩慢地松開按鈕，使溶液慢慢進入吸頭內(nèi)；否則，可使吸入體積減少。

第10頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月移液器的校正在25℃時，水的密度大約為1g/ml（mg/ul）.

如要校正2-20ul移液器，取10和20ul水于分析天平上分別稱三次。如要校正20-200ul移液器，測量100和200ul的水。如要校正100-1000ul移液器，測量500和1000ul的水。

如果你的移液器誤差超過了5%，請通知老師。第11頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月離心管的使用手持離心管時注意不要觸碰離心管內(nèi)表面，包括蓋子內(nèi)表面第12頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗中加入任何試劑后應(yīng)注意樣品的混勻?；靹颉⒈氐确磻?yīng)后樣品應(yīng)瞬時離心將內(nèi)容物收集至管底后再進行下步的實驗。實驗過程中應(yīng)做好每個樣品的標記工作，且一般在離心管上用記號筆作標記時，應(yīng)在兩處重復(fù)做好標記。第13頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月基因克?。―NA重組）克?。簛碜酝皇甲娴南嗤北净蚩截惖募稀？寺』韩@取同一拷貝的過程。

DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重組DNA）：應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將外源性遺傳性物質(zhì)（DNA）與載體結(jié)合成重組DNA分子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。第14頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月工具酶

工具酶

功能限制性核酸內(nèi)切酶

識別特異序列，切割DNADNA連接酶

催化DNA中相鄰的5’磷酸基和3’羥基形成二酯鍵DNA聚合酶I

a.合成cDNA的第二條鏈b.缺口平移c.測序d.補平反轉(zhuǎn)錄酶

合成cDNA多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5‘羥基末端磷酸化末端轉(zhuǎn)移酶

同聚物加尾堿性磷酸酶

切除末端磷酸基第15頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶主要來源于原核生物，具有識別自身DNA或異源DNA的功能，通過切割破壞或限制異源DNA分子侵入宿主細胞來保護自身。識別特性：具有雙鏈對稱的回文結(jié)構(gòu)

↓

5’

–GAATTC-3’3’

–CTTAAG-5’↑第16頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶命名：HindIII

屬種株同一株具不同特異性酶分類：根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三類。DNA重組技術(shù)中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。同裂酶（異源同功酶）：來源不同，識別的是同樣的核苷酸靶子序列。同裂酶產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。同尾酶：來源各異，識別的靶序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。

BamHⅠ：BglⅡ：第17頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月目的基因cDNA：complementaryDNA

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA互補的單鏈DNA?；蚪MDNA：代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。目前獲取目的基因的幾種途徑或來源化學(xué)合成法用適當方法篩選cDNA或gDNA文庫就可以分離到目的基因。RT-PCR(從mRNA合成cDNA)

從染色體DNA中分離第18頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月載體載體的分類按來源：質(zhì)粒、噬菌體、病毒按產(chǎn)物：克隆載體、表達載體按宿主細胞：原核細胞載體、真核細胞載體供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)表達或復(fù)制的運載工具。功能：1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；3.為外源基因的擴增或表達提供條件。載體具備條件1.自主穩(wěn)定復(fù)制2.多克隆位點3.遺傳標記4.分子量小，插入容量大5.細胞內(nèi)拷貝多6.安全第19頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.細菌質(zhì)粒

是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。

2.噬菌體（phage）噬菌體是感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。

3.黏性質(zhì)粒（cosmid）是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。表達型載體將上述細菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體。第20頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月不同類型載體容量第21頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒pUC19的分子結(jié)構(gòu)①②③④第22頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月重組DNA技術(shù)的基本流程1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達第23頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程第24頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月PartIV：蛋白表達載體的構(gòu)建

第25頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆基因的表達體系

1．原核表達體系

將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。

大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細胞系統(tǒng)的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。操作方便、快捷，需時較短，表達量大，適合工業(yè)化生產(chǎn)

大腸桿菌表達體系中尚有一些不足之處：①由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達克隆的cDNA，不宜表達真核基因組DNA②由于缺乏適當?shù)姆g后加工機制，表達的真核蛋白質(zhì)不能形成適當?shù)恼郫B或進行糖基化修飾③表達的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具有活性尚需進行復(fù)雜的復(fù)性處理④很難表達大量的可溶性蛋白。

第26頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆基因的表達體系2．真核表達體系與原核表達體系比較，真核表達體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)勢性。尤其是哺乳類動物細胞，不僅可表達真核的cDNA，而且還可表達真核基因組DNA第27頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗?zāi)康膩砜紤]，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結(jié)在表達載體的選擇上。

第28頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月一個合格表達載體的組成要素

復(fù)制起始位點Ori即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只有一個復(fù)制起始點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點?？股乜剐曰蚩梢员阌诩右詸z測，如Amp+,Kan+多克隆位點MCS克隆攜帶外源基因片段P/E啟動子/增強子Terms終止信號加poly（A）信號可以起到穩(wěn)定mRNA作用第29頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月pPROEXHT蛋白表達載體第31頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月原核表達系統(tǒng)中的各因素復(fù)制子

：通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān)篩選標記和報告基因：氨芐青霉素，卡那霉素

啟動子：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一組成型表達

:組成型啟動子

誘導(dǎo)調(diào)控型表達

:IPTG融合表達：GST,His-Taq分泌表達

:信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜

可溶性表達

:轉(zhuǎn)錄終止子

:控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降

核糖體結(jié)合位點

:多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列

表達菌株

:不同的表達載體對應(yīng)有不同的表達菌株第32頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月對原核表達載體應(yīng)該注意3點：①選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌；②用于表達真核蛋白質(zhì)時注意閱讀框錯位；③根據(jù)表達天然蛋白質(zhì)或融合蛋白來選擇相應(yīng)的表達載體。第33頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月GST克隆載體的選擇與構(gòu)建昆蟲谷胱氨肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因pPROEX-HT載體體外表達GST蛋白第34頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月GGCACGAGGCAACAAAATGGCCAAGAAACTACATTATTTCCATTTGAACGGGCTTGCTGAGTCCATCAGGTACATCCTGCACTACGGCGGACAAAAGTTCGAGGATGTCAGATACGATCTGAAAAGCTGGCCCATCAAGAGTGTGAAAGACACTCTCCCATACGGCCAGCTGCCACTCTACGAGGAGGGAAATAAGACCCTAAACCAGTCACTGGCCATCGCGCGCTACGTAGCTGCCCAGGTCCACCTCCTGCCCACCGATCCCTGGGAGCAGGCCGTCCTGGATGCCATCGTCTTCAACATCTATGACTTCTGGGGAAAGATTCTGGTCTTCATCAAGGAGAATGATGCTGCTAAGAAGGAGGTAATCAAGAAGGAGATCATAAACGAATCCGTTGACTTCTTCTTCTCCCGATTTGAGAAGGAACTTAAGGCCAACAAGGGATTCTTCAACGGAAAGCTGAGCTGGGCTGACTTCGTCCTTGTGGGCATCGTCGAGTCTGCAAACCTGTNCCTTGGCACCGAGATTGAGAAGAAATACCCCACCGTGCTCGTGCTCGTCCAGAAAATCGCACCCTCCCTGGAGTGAAGGANTCATCGCGACTAGGAAACCATATGCTCTATAAATAAAGTACACGTACTGTAAAAAAAAAAAAAAPrimers：GGCACGAGGCAACAAAATGGCGTGTACTTTATTTATAGAGCATATGGGSTnucleotidesequenceandopenreadingframe(yellow)第35頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第36頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月pPROEXHT蛋白表達載體第37頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月GSTinpGEM-easyvector

GGAATTCGATTGGCACGAGGCAACAAAATG……EcoRI第39頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月GST體外蛋白表達的實驗流程第40頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月第二部分：質(zhì)粒DNA的提取第41頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月PartI：質(zhì)粒DNA提取的原理

第42頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是質(zhì)粒（plasmid）？質(zhì)粒是染色體外的穩(wěn)定遺傳因子大小1-200Kb雙鏈、閉環(huán)、超螺旋DNA主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并表達所攜帶的遺傳信息。第43頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA基本原理

質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達到的目的。當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同,染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入中和液后,溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性，在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過離心可沉淀大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)?？捎梅勇确鲁樘徇M一步純化質(zhì)粒DNA。第44頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月PartII：質(zhì)粒DNA提取的

方法步驟

第45頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的提取方法方法：堿裂解法；煮沸裂解；羥基磷灰石柱層析法，質(zhì)粒DNA釋放法；酸酚法等。概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離質(zhì)粒DNA(有時還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實驗所需)第46頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實驗要求第47頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月堿裂解法1．收集菌體：取1.5ml培養(yǎng)液至Ep管中，12000rpm離心1min，棄上清，取沉淀。2．溶解菌體：將細菌沉淀懸浮于100μl預(yù)冷溶液Ⅰ中，強裂振蕩混勻。3．變性：加入200μl溶液Ⅱ，蓋嚴管蓋輕柔顛倒5-6次以混勻內(nèi)容物，冰上放置5分鐘。4．復(fù)性：加入150μl溶液Ⅲ，溫和振蕩數(shù)次，冰上放置５分鐘。5．12000rpm離心５分鐘，取上清移到１個新的Ep管中。6.取上清（≈420ul），分別加入1/2體積酚(210ul)，和1/2體積氯仿/異戊醇（24:１）(210ul)，渦旋震蕩混勻溶液。第48頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月7.12000rpm、離心5分鐘。小心移取上清液（≈400μl)至另一個新1.5mlEp管中。8.上清液加入２倍體積（≈800ul）預(yù)冷無水乙醇，混勻，于-20℃中靜置0.5h。9.12000rpm,離心5分鐘。棄上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，蓋嚴管蓋顛倒數(shù)次，１２000rpm離心10分鐘。10．干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，然后瞬時離心，再將殘余的少量液體移走，用溫和的電吹風(fēng)吹干DNA沉淀（以看不到液滴為準）。11．加入50μlTE（含20μg/mlRNA酶，不含DNA酶）溶解DNA，-20℃下保存?zhèn)溆?。?9頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS(新鮮的)；

溶液III，3M醋酸鉀/2M醋酸。

溶液I:Tris-Cl:適當pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解,懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部,

EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑)溶液IINaOH：是最佳的溶解細胞的試劑。這一步要記住兩點：第一，不能用舊的NaOH；第二，時間不能過長，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂SDS:是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。溶液III醋酸鉀:K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；高濃度的鹽，使得沉淀更完全（在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀）。2M的醋酸:中和NaOH，創(chuàng)造質(zhì)粒復(fù)性的環(huán)境。

第50頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)1水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；

2.酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)）

3.異戊醇，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。而且加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。保護層（水相）飽和酚（0.25％8-羥基喹啉）第51頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗一、質(zhì)粒DNA提取準備工作：（一）固體LB(luria-Bertani)培養(yǎng)基的制備（100mL）：稱量0.5g胰蛋白胨，0.5gNaCl，1.0g酵母粉，1.5g瓊脂粉，加入去離子水至100ml，混勻；高壓蒸汽滅菌15-20min；取出，移入超凈工作臺，待涼至50-60oC時加入氨芐青霉素（50mg/ml）至終濃度為50ug/ml，混勻?qū)⑴囵B(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)基覆蓋皿底即可，每皿約20ml）半蓋上培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基徹底冷卻后（15min），合上培養(yǎng)皿蓋，倒放置于4

oC冰箱中。第52頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）細菌劃線培養(yǎng)：目的：產(chǎn)生單菌落，供后續(xù)克隆分析注意：通常37oC培養(yǎng)過夜（12-14小時）第53頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）液體擴大培養(yǎng)：液體LB培養(yǎng)基的制備：同固體LB，但不加瓊脂粉，滅菌。在超凈工作臺中，加入3mlLB至一滅菌的試管中，加入3ul50mg/ml的AmP用小槍頭挑一單菌落，連槍頭一起放入試管中，37oC250rpm培養(yǎng)過夜。第54頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒提?。═IANprepMiniPlasmidkit)1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中2.收集菌體：取1.5ml培養(yǎng)液至Ep管中，12000rpm離心1min，棄上清（盡量移除上清）。3．溶解菌體：將細菌沉淀懸浮于250ul溶液P1中（請先檢查是否加入RNaseA），渦旋振蕩混勻。4．變性：加入250ul溶液P2，蓋嚴管蓋輕柔顛倒6-8次,使菌體充分裂解。(此時菌體變得粘稠、澄清)5．復(fù)性：加入350μl溶液P3，立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次（此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀）；12000rpm離心10分鐘。6.取上清，轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中。第55頁，課件共62頁，創(chuàng)作于2023年2月7.向吸附柱CP3中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（請先檢查是否已經(jīng)加入無水乙醇），12000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放回收集管中