生物安全管理體系文件

實(shí)驗(yàn)室生物安全管理制度

目的：確保實(shí)驗(yàn)人員生物安全，環(huán)境不受污染，樣品質(zhì)量不受影響特制定該管理制度。一、人員準(zhǔn)入條件1、實(shí)驗(yàn)室人員、輔助人員和外來人員必須具備相應(yīng)的專業(yè)技能、受過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室生物安全培訓(xùn)、了解實(shí)驗(yàn)室潛在的生物危害和特殊要求，經(jīng)負(fù)責(zé)人審批后方可進(jìn)入相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室工作。2、未成年人、孕婦和有免疫缺陷的人員不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，處于易受感染狀態(tài)或感染后果嚴(yán)重的額人員也不得進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。3、實(shí)驗(yàn)室人員必須在身體狀況良好、穿戴好防護(hù)服（白大衣）的情況下，方能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的污染區(qū)域工作。但當(dāng)身體出現(xiàn)較大的開放性損傷、處于較重的疾病感染狀態(tài)或呈重度疲勞狀態(tài)時不得進(jìn)入。4、外來參觀人員需經(jīng)科室負(fù)責(zé)人同意并在相關(guān)人員陪同下方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。二、生物安全日常管理：(一)生物安全行為規(guī)范1．進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前要摘除首飾，修剪指甲，以免刺破手套。長發(fā)應(yīng)束在腦后，禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)穿露腳趾的鞋。不得佩戴有可能被卷入機(jī)器或可隨人傳染性物質(zhì)的飾物。2．在實(shí)驗(yàn)室里工作時，要始終穿著實(shí)驗(yàn)服，實(shí)驗(yàn)室外禁止穿防護(hù)服（白大衣）。大白衣應(yīng)定期清洗、更換，清洗時應(yīng)使用具有殺菌消毒的洗液或其他相應(yīng)方法。3、操作感染性物質(zhì)、腐蝕性或毒性物質(zhì)時須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并佩戴相關(guān)的安全防護(hù)用品，如安全鏡、面罩或護(hù)目鏡。皮膚受損時應(yīng)以防水敷料覆蓋。4、當(dāng)有必要保護(hù)眼睛和面部以防實(shí)驗(yàn)對象噴濺、或紫外線輻射時，必須要配戴護(hù)目鏡，面罩（帶護(hù)目鏡的面罩）或其它防護(hù)用品。5、實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)不允許吃、喝、化妝和操作隱形眼鏡，禁止在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)的任何地方貯存人用食品及飲料。6、實(shí)驗(yàn)室防護(hù)服不應(yīng)和日常服飾放在同一柜子。個人物品、服裝和化妝品不應(yīng)放在有規(guī)定禁放的和可能發(fā)生污染的區(qū)域。7、不得涉及呼吸道傳播疾病樣品室，要佩戴符合要求的防護(hù)口罩。(二)操作準(zhǔn)則1、所有樣本、培養(yǎng)物均可能有傳染性，操作時均應(yīng)帶手套。在認(rèn)為手套已被污染時應(yīng)脫掉手套，馬上洗凈雙手，再換一雙新手套。2、當(dāng)實(shí)驗(yàn)過程可能涉及到直接或意外接觸到血液、有傳染性的材料或被感染的動物時，必須要戴上合適的手套，脫手套后必須洗手。在實(shí)際或可能接觸了血液、體液或其他污染材料后，即使戴有手套也應(yīng)立即洗手。3、不得用戴手套的手觸摸自己的眼、鼻子或其他暴露的黏膜或皮膚。不得帶手套離開實(shí)驗(yàn)室或在實(shí)驗(yàn)室來回走動。4、嚴(yán)格禁止用嘴操作實(shí)驗(yàn)器材，包括吸液、吹酒精燈等。實(shí)驗(yàn)材料禁止放入嘴里。禁止舔標(biāo)簽。5、盡量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破損的玻璃不能直接用手直接操作，必須用機(jī)械方法清除，如刷子、夾子、鑷子等。破裂的玻璃器具和比例碎片應(yīng)丟棄在有專門標(biāo)記的、單獨(dú)的，不易刺破的容器里。6、所有的實(shí)驗(yàn)步驟都應(yīng)盡可能使氣溶膠或氣霧的形成控制在最小程度。任何使形成氣溶膠的危險性上升的操作都必須在生物安全柜里進(jìn)行。有害氣溶膠不得直接排放。7、應(yīng)盡可能減少使用利器和盡量使用替代品。包括針頭、玻璃、一次性手術(shù)刀在內(nèi)的利器，應(yīng)在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器應(yīng)在內(nèi)容物達(dá)到三分之二前置換。8、所有濺出事件、意外事故和明顯或潛在的暴露于感染性材料，都必須向?qū)嶒?yàn)室負(fù)責(zé)人報告。此類事故的書面材料應(yīng)存檔。9、所有棄置的實(shí)驗(yàn)室生物樣本、培養(yǎng)物和被污染的廢棄物應(yīng)被假定有傳染性，在從實(shí)驗(yàn)室中取走之前，應(yīng)以安全方式處理和處置，使其達(dá)到生物學(xué)安全。10、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持整潔、干凈，當(dāng)潛在的危險物濺出或一天的工作結(jié)束后，所有操作臺面、離心機(jī)、加樣槍、試管架必須擦拭、消毒。11、每日工作完畢，最后一個離開實(shí)驗(yàn)室的人員需關(guān)好水、電、門、窗。(三)監(jiān)督與檢查1、涉及病原體的科室負(fù)責(zé)人要經(jīng)常對各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的生物安全性進(jìn)行檢查和監(jiān)督。2、各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目主管人員要定期對所開展的實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)行監(jiān)督與檢查，及時發(fā)現(xiàn)并報告安全隱患事件。三、常見實(shí)驗(yàn)室廢棄品處理

實(shí)驗(yàn)室廢棄品按物理類型而言可分為固體廢棄品、液體廢棄品及氣體廢棄品，就危害類型而驗(yàn)分為化學(xué)毒性廢品和病原性廢品，由于廢棄物品具有潛在的致病性、傷害性，如不妥善處理會造成很大的人身危害、環(huán)境污染和社會危害。根據(jù)《國家危險廢物品名錄》、《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》、衛(wèi)生部和國家環(huán)境保護(hù)總局制定的《醫(yī)療廢物分類目錄》有關(guān)規(guī)定的要求，對實(shí)驗(yàn)室廢棄物進(jìn)行分類，主要包括感染性廢棄物、病理性廢棄物、損傷性廢棄物、化學(xué)性和放射性廢棄物等。分類特征常見廢棄物名稱處理程序感染性廢棄物攜帶病原微生物具有引發(fā)感染性疾病傳播危險的廢棄物包括被感染性實(shí)驗(yàn)材料等污染的物品與器材，如手套、口罩與白大衣、試管、平皿、吸管等實(shí)驗(yàn)器材以及廢棄的感染性實(shí)驗(yàn)標(biāo)本、培養(yǎng)液、培養(yǎng)基等。放入盛有適宜消毒液的不易碎裂的容器中浸泡。注意消毒劑的種類、濃度及浸泡時間，浸泡后放入合適的容器內(nèi)進(jìn)行高壓滅菌或焚燒處理病理性廢棄物實(shí)驗(yàn)動物尸體等廢棄物包括廢棄的質(zhì)粒、細(xì)胞、單克隆課題、臨床、組織樣本及實(shí)驗(yàn)動物組織、尸體等。集中與實(shí)驗(yàn)室指定位置，嚴(yán)格與感染性生物材料區(qū)分，高壓滅菌后廢棄。盛放容器宜浸泡消毒。損傷性廢棄物能刺傷或割傷人體的銳器等廢棄物包括醫(yī)用枕頭、縫合針、手術(shù)刀及破碎玻璃等高壓滅菌或焚燒處理，盛放銳器的一次性容器不易刺破，不宜將容器裝得過滿（小于四分之三），如感染性廢棄物進(jìn)行高壓滅菌及焚燒處理化學(xué)性、放射性廢棄物具毒性、腐蝕性、易燃易爆的化學(xué)性廢棄物及放射性廢棄物包括強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等有毒有害的化學(xué)性廢棄物一級放射性廢棄物等。強(qiáng)酸強(qiáng)堿等化學(xué)性物品須經(jīng)中和消除腐蝕行后方可廢棄，其他物品經(jīng)稀釋對環(huán)境與人體無毒后可廢棄。含有毒、有害化學(xué)物品的實(shí)驗(yàn)材料在使用后應(yīng)置于帶明顯危險標(biāo)志的容器內(nèi)送至指定地點(diǎn)統(tǒng)一處理。

四、支持文件1.《中華人民共和國傳染病防治法》2.《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》3.《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(改變9489-2004)4.《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》（WS233-2003）5.《實(shí)驗(yàn)室生物安全守則》（WHO,第三版，2004年）6.《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全》（生物安全培訓(xùn)衛(wèi)生部規(guī)劃教材，第2版）7.《醫(yī)療廢棄物管理?xiàng)l例》8.《實(shí)驗(yàn)室生物安全》病毒制備質(zhì)量管理體系目錄原始病毒的擴(kuò)增大量病毒制備的滅菌操作病毒制備程序痘苗病毒的收獲和純化腺病毒的收獲和純化病毒滴度測定病毒質(zhì)控細(xì)菌污染及檢測支原體污染及檢測基因檢測病毒活性檢測體外細(xì)胞殺傷復(fù)制能力檢測

原始病毒的擴(kuò)增---病毒種子制備一般原始病毒的擴(kuò)增用優(yōu)質(zhì)（無污染-須通過細(xì)菌和支原體檢測）CV1/JH293細(xì)胞，每種原始病毒的擴(kuò)增需要在一個細(xì)胞融合度≧80%（細(xì)胞處于對數(shù)生長期，活性好，感染效率高）的T175培養(yǎng)瓶中進(jìn)行：細(xì)胞計數(shù)：培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，鏡下觀察，將狀態(tài)良好，融合度≧80%的細(xì)胞移至超凈工作臺。去除細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基。PBS沖洗：從無細(xì)胞一側(cè)加入適量（約10ml）PBS沖洗細(xì)胞后棄上清，酌情反復(fù)1~2次，以達(dá)到徹底洗掉培養(yǎng)基中的血清成份。消化細(xì)胞：加入1ml0.25%胰酶消化液，使之鋪滿細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱（37℃）作用數(shù)分鐘后，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大；或肉眼觀察，見到瓶底出現(xiàn)細(xì)針孔間隙傾斜瓶子出現(xiàn)流沙樣現(xiàn)象即可終止消化。終止消化：輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，從無細(xì)胞面?zhèn)燃尤脒m量完全培養(yǎng)基（含血清的DMEM）終止消化，并用移液管吸吹數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混合均勻，使之成為單細(xì)胞混合液。計數(shù)板準(zhǔn)備：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。加樣：用移液管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液（可酌情稀釋），在計數(shù)板上蓋玻片一側(cè)靠虹吸現(xiàn)象加入微量（約10ul）細(xì)胞懸液，使之充滿玻璃槽，不可產(chǎn)生氣泡，不可溢出外側(cè)亦不可溢入對側(cè)玻璃槽。如產(chǎn)生上述情況需對計數(shù)板沖洗拭干重新加樣。計數(shù)：靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移，將細(xì)胞計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于活細(xì)胞的遮光率和液體的折光率相近，觀察時應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。計數(shù)時計數(shù)區(qū)是由16個中方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格的細(xì)胞數(shù)，為了保證計數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定計數(shù)原則：計上不計下，計左不計右！如細(xì)胞位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計入相應(yīng)的格中。按下式計算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml＝4個大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

×稀釋倍數(shù)感染種子：取平行對照培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)融合度≧80%的細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基并加入含病毒種子的30mL感染培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1pfu/cell），輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使病毒在培養(yǎng)基中充分混勻。3.收集種子：標(biāo)記病毒種類和培養(yǎng)日期，在37oC，5%CO2條件下培養(yǎng)。定時（24h/48h/60h/72h)檢查CPE(細(xì)胞變圓變亮脫壁，漂浮)，待≧80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即可收集。將含病毒細(xì)胞懸液加入50mL離心管中，標(biāo)記病毒種類和日期，凍存于-80℃?zhèn)溆?，并測定病毒滴度，以備感染病毒使用。

大量病毒制備的滅菌準(zhǔn)備工作用過的500mL離心瓶泡入酸液中，過夜，沖洗干凈，烤干，高溫滅菌。準(zhǔn)備足量T175培養(yǎng)瓶必須泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥，滅菌包布包被滅菌。培養(yǎng)細(xì)胞所用的移液管，離心管必須泡入酸液中，過夜，用沖洗干凈，干燥，滅菌包布包被滅菌。離心管泡入酸液中，過夜后再處理，針頭直接滅菌，在移除針頭錢，確保離心管實(shí)在一個大燒杯上，這樣漏液不會污染操作臺。研磨器泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥，滅菌包布包被滅菌。Beckman超高速離心機(jī)及特制轉(zhuǎn)子和離心管準(zhǔn)備。V型槽，96孔板，排槍準(zhǔn)備。

病毒制備程序細(xì)胞準(zhǔn)備：建立細(xì)胞種子庫：復(fù)蘇細(xì)胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293用于腺病毒病毒）分別于與第3/5/7/14天取上清兩份，一份用于支原體檢測，另一份加至培養(yǎng)基中放于培養(yǎng)箱中定時鏡下觀測，用于細(xì)菌檢測，保證細(xì)胞質(zhì)量。待細(xì)胞生長細(xì)胞融合度≧80%消化傳代擴(kuò)增并凍存足量細(xì)胞種子于液氮中，凍存管上須準(zhǔn)確標(biāo)記所凍細(xì)胞名字，代數(shù)，凍存人以及凍存日期等相關(guān)信息。（慢凍速溶）細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)：當(dāng)1瓶T175培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長融合度≧80%時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，各加入1ml胰酶消化，37℃，2-3分鐘；加入適量（5ml）完全培養(yǎng)基終止消化，全部轉(zhuǎn)移至50ML離心管中，總量為6ml。分別抽取2ml此混合液加入含18ml完全培養(yǎng)基（含10%血清）的T175培養(yǎng)瓶中共三瓶繼續(xù)培養(yǎng)（1傳3），原瓶繼續(xù)培養(yǎng)待下一次傳代。繼而同上方法擴(kuò)增至12瓶T175培養(yǎng)瓶培養(yǎng)（1傳4）細(xì)胞生長融合度≧80%時同上方法擴(kuò)增至36瓶為一批（1傳3），其中1瓶T175培養(yǎng)瓶中細(xì)胞作為平行對照，放入37℃CO2孵育箱中培養(yǎng)48-72小時。平行對照培養(yǎng)瓶同時放入孵育箱，直至融合度≧80%。二．病毒感染：觀察平行對照培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長率≧80%時，準(zhǔn)備進(jìn)行病毒感染；同時也觀察其它所有細(xì)胞，對比細(xì)胞增殖速度是否一致。取平行對照瓶細(xì)胞計數(shù)，并計算需要感染病毒量（1pfu/cell)。-80℃冰箱中取出測定過病毒滴度的病毒種子，按計算好的病毒量配制1080ml（30ml/瓶×36瓶）含2%血清的DMEM培養(yǎng)基。放入37℃二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)48-72小時，或直到≥90%細(xì)胞都出現(xiàn)CPE。痘苗病毒的收獲和純化病毒收獲：從37℃二氧化碳孵育箱中取出達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)的36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，少量貼壁細(xì)胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打未脫落細(xì)胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。移至高速離心機(jī)中配平，3500rpm，15min，4℃離心。棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。方法同上，用冷PBS反復(fù)清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉(zhuǎn)致同一50ml離心管中。移至高速離心機(jī)中配平，3500rpm，15min，4℃離心。棄上清，4℃取7ml冷VV-Buffer重懸混勻，并凍存于-80℃待純化。病毒純化：將待純化病毒溶液在液氮與37℃水浴鍋中反復(fù)凍融三次，使包含于細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒完全釋放。將完全融化的病毒液移至超凈工作臺，加入滅菌的研磨器中勻速緩慢反復(fù)研磨60次。將研磨好的病毒液轉(zhuǎn)入50ml離心管中配平，1200rpm，5min，4℃離心。吸取上清于另一50ml離心管中，取3mlVV-Buffer重懸沉淀，2mlVV-Buffer沖洗離心管，加至同一50ml離心管，將混合液再次加入研磨器中反復(fù)研磨60次。將研磨好的病毒液轉(zhuǎn)入50ml離心管中配平，1200rpm，5min，4℃離心。取上清于一新的無菌離心管中，移至超聲儀中超聲（破碎）兩次，每次20s。在SW41Beckman離心機(jī)專用離心管中加入7ml36%蔗糖（w/v)〖10MMTris-Hcl（PH9.0）配制〗，再沿管壁緩慢加入3.5ml研磨超聲處理過的病毒液，使之形成分層。用VV-Buffer稱重配平，誤差須小于0.5g（誤差越小越好），移至Beckman離心機(jī)中（1~4/2~5/3~6轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平）13500rpm/32900xg，80min，4℃。待離心結(jié)束，將轉(zhuǎn)子移至超靜工作臺打開，用鑷子小心拿掉轉(zhuǎn)子蓋子，切勿污染，再用無菌鑷小心取出離心管，去除上清，取6mlVV-Buffer重懸沉淀。梯度蔗糖：底層為4ml40%蔗糖溶液(用10mMTris-HCLpH9.0配制)，依次向上分別為4ml35%蔗糖溶液；4ml30%蔗糖溶液和4ml25%蔗糖溶液（最上層）。每個病毒樣本制備至少兩份梯度，分別小心在上層加入病毒懸液，使之形成分層。用10mMTris-Hcl（PH9.0）稱重配平，誤差須小于0.5g（誤差越小越好），移至Beckman離心機(jī)中（1~4/2~5/3~6轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平）20000rpm，60min，4℃。待離心結(jié)束，將轉(zhuǎn)子移至超靜工作臺打開，用鑷子小心拿掉轉(zhuǎn)子蓋子，切勿污染，再用無菌鑷小心取出離心管，去除上清，取2mlVV-Buffer重懸沉淀。病毒分裝與儲存：取滅菌EP管，取少量病毒液進(jìn)行滴度測定，其余根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按20ul/50ul/100ul/支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝凍存于-80℃冰箱病毒庫。腺病毒的收獲和純化三.病毒收獲：從37℃二氧化碳孵育箱中取出達(dá)到收獲標(biāo)準(zhǔn)的36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，少量貼壁細(xì)胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打未脫落細(xì)胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。移至高速離心機(jī)中，2000rpm，10min，4℃離心。棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。方法同上，分別用冷PBS5ml反復(fù)清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉(zhuǎn)致同一50ml離心管中。移至高速離心機(jī)中配平，1000rpm，10min，4℃離心。棄上清，4℃取12ml冷的10mMTris.HCI(Ph8.0)重懸混勻，并凍存于-80℃待純化。四．病毒純化：將制備的含病毒溶液在液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融三次。將該溶液37℃水浴融化，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，室溫，6000rpm離心10分鐘。保留上清，凍存于-80℃冰箱或立即進(jìn)行CsCI梯度離心。將6只超高速離心用離心管中分別先加入10ml1.25g/mlCsCI.再小心輕輕加入7.6ml1.4g/mlCsCL,然后將病毒混合液平均輕輕加入CsCI液面上。稱重，用滅菌的Tris.HCI(Ph8.0)配平，誤差＜0.1g。將離心管放入BeckmanSW32轉(zhuǎn)子中，放入LE-80K超速離心機(jī)中（1~4/2~5/3~6轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平）離心，25000rpm，15℃，2小時。小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用19號針頭刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物（病毒條帶呈乳白色），盡量多抽，將所抽出液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。將50ml離心管中含病毒液體順液面輕輕平均分配加入至已加入3ML1.35g/mlCsCI溶液的5ml超高速離心用離心管中。用Tris.HCI(Ph8.0)稱重配平，誤差＜0.1g。將離心管放入BeckmanSW41轉(zhuǎn)子中，放入LE-80K超速離心機(jī)中（1~4/2~5/3~6轉(zhuǎn)子對應(yīng)配平）離心，40000rpm，15℃，15小時。小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用19號針頭刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物（病毒條帶），盡量少抽，將所抽出液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中。將液體注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析24小時。病毒分裝與儲存：透析結(jié)束后，將透析袋轉(zhuǎn)至無菌工作臺中，取少量病毒液進(jìn)行滴度測定，其余病毒液根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要按20ul/50ul/100ul/支并按規(guī)定明確標(biāo)記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝儲存于-80℃冰箱病毒庫。病毒滴度測定（TCID50）培養(yǎng)CV-1（VV）或JH293（AD）細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長率≧80%時，將各培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，各加入少量胰酶消化，37℃，2-3分鐘；再各加入5mL10%FBS的DMEM培養(yǎng)基混勻，細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果將細(xì)胞鋪入96孔板，每孔3×103細(xì)胞于200微升10%FBS的DMEM，過夜。第二天早晨，按比例稀釋病毒，一般是1：105稀釋：10ul病毒原液10ul病毒原液990ulDMEM 2997ulDMEM3ul2997ulDMEM3ul混合液20ul20ul排槍加至96孔板第一排第一排用排槍加入20微升，輕輕混勻5次，去掉槍頭；從第一排吸取22微升加入到的第二排，輕輕混勻5次;同樣從第二排吸取22微升加入到第三排，輕輕混勻5次；依次到倒數(shù)第二排，最后一排做對照。5.從感染病毒起，第8~10天觀察。先觀察最后一排細(xì)胞狀態(tài)，長滿時，計每排CPE的數(shù)值。計算病毒滴度。6.代入以下表格計算病毒滴度：病毒質(zhì)控細(xì)菌污染及檢測；支原體污染及檢測；基因檢測；病毒活性檢測；體外細(xì)胞殺傷復(fù)制能力檢測。細(xì)菌污染及檢測：1.1背景介紹：細(xì)菌是一種元和細(xì)胞微生物，其大小以微米計。常見的污染細(xì)菌有革蘭氏陰性菌和假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄菌等比較常見。純化后的病毒有細(xì)菌污染時并不容易發(fā)現(xiàn)。所以，做病毒的細(xì)菌質(zhì)控非常必要。1.2實(shí)驗(yàn)步驟：當(dāng)做細(xì)菌檢測時，可以取10ul已經(jīng)純化好的病毒加入無抗生素4ml的培養(yǎng)基（目前實(shí)驗(yàn)室所用的是LB培養(yǎng)基）試管中，將試管置于37℃，1800rpm的搖床上搖過夜（12-16h）,如果有細(xì)菌污染，16h內(nèi)就可獲得陽性結(jié)果。1.3結(jié)果判讀：多數(shù)情況下當(dāng)受到細(xì)菌污染時，培養(yǎng)基短時間內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，此時的培養(yǎng)基稍加振蕩就會有混濁物懸起。在倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)基有大量圓球狀顆粒漂浮，此種情況即可判定為陽性，病毒受到細(xì)菌污染。若無，則判讀為陰性。支原體污染及檢測：2.1背景介紹：支原體是一種介于細(xì)胞和病毒之間、能獨(dú)立生活的最小微生物，最小的直徑0.2um,約有1%可通過濾菌器，無細(xì)胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨形。在光鏡下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體的污染是一個常見又棘手的問題。支原體污染后，因它可與病毒長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生混濁，外觀上往往給人以“正?！钡母杏X，實(shí)則可能對后期實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生潛在影響，所以對支原體的污染必須嚴(yán)加防范。支原體污染常用檢測方法有相差顯微鏡法、DNA熒光處理法、電鏡檢測法、低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察、支原體PCR檢測法等。實(shí)驗(yàn)室目前使用的是PCR檢測法。2.2實(shí)驗(yàn)步驟：（1）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：①樣本和對照準(zhǔn)備：樣本：收集待檢測病毒樣本，若為病毒原液則可用5ul原液加495ul細(xì)胞培養(yǎng)基（確定無污染）進(jìn)行100倍稀釋。陽性對照：從醫(yī)院取得支原體陽性樣本，高壓滅菌后（可分裝50ul一支）做陽性對照。陰性對照：滅菌蒸餾水。②引物的準(zhǔn)備：Fwd-1.：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAFwd-2.：CCTAAAGGAATTGACGGGAACCCGRev.：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC以上引物可以檢測出常見的14種不同支原體。按要求稀釋為50pmol/ul，分裝為50ul/管，﹣20℃保存，待使用。（2）PCR反應(yīng)：配置全過程需在冰上操作：1stRound–bandat720bp按下列組分配置PCR反應(yīng)液：滅菌蒸餾水upto20ul10*PCRBuffer2ulDntp(2.5mM)MIX1.6ulMIXMgCl2(25mM)1.2ulFwd-1.1ulRev.1ulTaq酶0.3ul樣本/對照1ul1st反應(yīng)條件95℃x30s95℃x30s56℃x30s35cycles72℃x1min72℃x1min反應(yīng)大約需1.5小時，由此得到第一輪相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，在打開PCR管前先離心甩一下，接著進(jìn)行第二輪145bp的PCR鑒定。2ndRound–Bandat145bp按下列組分配置PCR反應(yīng)液：滅菌蒸餾水upto20ul10*PCRBuffer2ulDntp(2.5mM)MIX1.6ulMIXMgCl2(25mM)1.2ulFwd-2.1ulRev.1ulTaq酶0.3ul第一輪PCR的產(chǎn)物（對應(yīng)樣本/對照）1ul加過模板，第一輪產(chǎn)物可加1ul10*lodingbuffer,混勻后先放置4℃冰箱。待跑瓊脂電泳膠。2nd反應(yīng)條件（與第一輪相同）95℃x30s95℃x30s56℃x30s35cycles72℃x1min72℃x1min第二輪產(chǎn)物加1ul10*lodingbuffer，終止反應(yīng)，跑瓊脂電泳膠。瓊脂電泳跑膠：①配置1%的瓊脂糖凝膠即可。首先將錐形瓶洗干凈，然后根據(jù)樣本量和膠的大小取一定量的電泳緩沖液（1×TAE）至錐形瓶中，再稱取相應(yīng)量的AGAROSE（瓊脂糖）倒入錐形瓶中，搖勻，最后放入微波爐加熱，煮膠的過程中需注意安全，應(yīng)適當(dāng)搖勻，防止爆沸。煮好的凝膠需無氣泡、色澤及質(zhì)地均勻。將煮好的凝膠放入均勻冷卻至50℃左右時，加入相應(yīng)EB,混勻，及時將凝膠倒入裝好的干凈模具中。待凝膠完全凝固（約30min）后，垂直方向拔梳子。此時，凝膠需平整、不漏孔，可以用于電泳檢測。②膠前準(zhǔn)備：先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標(biāo)記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央。膠孔的方向朝向負(fù)極（注意：①放凝膠前，需將膠托底部的凝膠抹干凈，防止膠托在電泳槽中滑動；②此時，可順便觀察凝膠是否漏孔）。再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1×TAE）至剛好將凝膠淹沒。（注意保持桌面衛(wèi)生，防止緩沖液灑到桌。上樣：將兩輪的產(chǎn)物和lodingbuffe混合后，輕甩，按照規(guī)定的順序上樣，上樣順序應(yīng)與電泳槽上的標(biāo)記一致。注意:上樣時必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點(diǎn)樣后的空管子先放在電泳槽旁邊，用于核查；點(diǎn)樣時不戳孔、不外漏、不溢出；點(diǎn)樣時需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動，若凝膠已經(jīng)挪動，需等樣品完全沉到底部后，再固定凝膠.樣品上完后，加陽性對照，陰性對照。每排膠上留一孔加Maker(D2000bp),5ul.跑電泳：確認(rèn)已經(jīng)正確上樣后，雙手同時蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽（注意：確認(rèn)電極正確連接），設(shè)置電泳參數(shù)：電壓：100V，電流：400mA，時間：25min；注意確認(rèn)電極、電泳參數(shù)完全正確之后，最后按star鍵開始電泳。凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的那個PE手套上（注意：撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的EB染液甩干），將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，按照“Tanon凝膠成像系統(tǒng)操作規(guī)程”進(jìn)行操作拍照。（注意：拍照時需嚴(yán)格區(qū)分EB污染區(qū)與非污染區(qū)，防止EB污染區(qū)污染電腦、鍵盤及鼠標(biāo)），最后保存膠圖信息至規(guī)定的文件夾內(nèi)，命名規(guī)則為：日期+姓名+工號+部門+電泳銅人陣考核。注意事項(xiàng)1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì)，務(wù)必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。操作時戴上乳膠手套，必要時戴上PE手套和口罩?；驒z測：試驗(yàn)1：BioTTT001基因組測序試驗(yàn)?zāi)康臋z測BioTTT001序列信息試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmpDNAbloodminikitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計ThermoNANODROPONE恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2試驗(yàn)過程病毒基因組提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混勻。1.2加入200ulALBuffer，震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，孵育10分鐘。1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml離心管中。1.5加入500ulBufferAW1，離心8000轉(zhuǎn)1分鐘。1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘濃度測定2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。送華大基因測序3.1準(zhǔn)備總量為2.5ug，濃度不低于80ng/ul的樣品，進(jìn)行測序。3.2華大基因進(jìn)行樣品檢測，并出示檢測報告。3.3樣品檢測合格后，建立樣品庫進(jìn)行測序。3.4數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)2：BioTTT001基因組酶切試驗(yàn)SOP目的通過酶切驗(yàn)證BioTTT001的構(gòu)建試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmpDNAbloodminikitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度EcoRVNEBR1095S-20度Buffer3.1NEBB7203S-20度瓊脂糖Invitrogen75510-019室溫DNAMarkerTIANGEN100bp4度儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計ThermoNANODROPONE恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500試驗(yàn)過程病毒基因組提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混勻。1.2加入200ulALBuffer，震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，孵育10分鐘。1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml離心管中。1.5加入500ulBufferAW1，離心8000轉(zhuǎn)1分鐘。1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘濃度測定2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。3.酶切3.1配制酶切體系基因組40ul(約500ng)EcoRV1ulBuffer3.15ul超純水4ul總體積50ul3.2混勻后，放于37度水浴鍋中，過夜酶切，約16-18小時。4.電泳4.1配制2%瓊脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘，4.2成像觀察。試驗(yàn)3：BioTTT001基因組PCR及插入基因IL-12PCR驗(yàn)證SOP目的利用PCR驗(yàn)證BioTTT001的構(gòu)建試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號存儲BioTTT001深圳S160324A-80度QIAmpDNAbloodminikitQIAGEN51104室溫蛋白酶KTIANGEN040204度2×MixVazyme102151-20度引物（詳見附注）DNAMarkerTIANGEN100bp4度儀器設(shè)備儀器品牌型號離心機(jī)ThermoIECMICROMAX微量分光光度計ThermoNANODROPONE恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2振蕩器SCIENTIFICINDUSTRIESVORTEXGENIX2PCR儀Lifetechnologies2720Thermalcycler瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500試驗(yàn)過程1.病毒基因組提取1.1向200ulBioTTT001原液中加入10ul蛋白酶K，混勻。1.2加入200ulALBuffer，震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，孵育10分鐘。1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉(zhuǎn)移樣品到新吸附柱中。1.4離心8000轉(zhuǎn)1分鐘，轉(zhuǎn)移吸附柱到新2ml離心管中。1.5加入500ulBufferAW1，離心8000轉(zhuǎn)1分鐘。1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2，14000轉(zhuǎn)離心3分鐘。1.7棄廢液，空轉(zhuǎn)1分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。1.8向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉(zhuǎn)離心1分鐘2.濃度測定2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進(jìn)行校準(zhǔn)。2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。2.3吸取1ul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。3.PCR3.1配制PCR體系：基因組0.5ul2×Mix2ulPrimer-F1ulPrimer-R1ul超純水16.5ul 總體積 20ul3.2混勻后，放于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系如下：94℃5min94℃30s55℃30s72℃40s72℃5min 4℃ +∞4.電泳4.1配制2%瓊脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘，4.2成像觀察。附注：引物信息95’forward第8對E3-gp19k上游3’reverse第11對nsIL12下游105’forward第11對nsIL12上游3’reverse第8對E3-gp19k下游115’forwardATGatatgggaactgaagaaag3’reverseTTAGGAAGCATTCAGATAG92871530109E3-gp19k+nsIL121394102853429135nsIL12+E3-gp19k601112853430109nsIL121575試驗(yàn)4：BioTTT001插入基因IL-12表達(dá)檢測SOP(ELISA)目的利用ELISA檢測BioTTT001插入基因IL12的表達(dá)水平試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)Gibco10378-016-20度HumanIL12ELISAKITeBioscience88-7126-884度儀器設(shè)備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIESA2細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800SERIES水浴鍋晶玻SS-H2酶標(biāo)儀BECKMANDTX880試驗(yàn)過程1.細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板1.1復(fù)蘇JH293一支，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時進(jìn)行傳代。1.2傳代3-5次，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。1.3利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。1.4使用含10%FBS-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞溶度為1.0X105/ml，2ml/孔進(jìn)行鋪板。1.5將六孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。2.病毒感染2.1培養(yǎng)14-18小時，觀察細(xì)胞完全貼壁后，消化其中3個孔，分別進(jìn)行計數(shù)，取平均值。2.2每個細(xì)胞感染5PFUBioTTT001，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒，每孔加2ml含病毒的無血清DMEM。2.3細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2小時，吸走含病毒培養(yǎng)基，2mlPBS/孔輕輕晃動清洗一次。2.4每個孔加入2ml10%FBS-DMEM培養(yǎng)基,放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3.樣品收集及凍融3.1分別于感染后24h、48h、72h及96h時，收集每孔的培養(yǎng)基，使用200ul吸頭（折彎）刮取貼壁細(xì)胞，與同孔的培養(yǎng)基收集于同一凍存管中；每個時間點(diǎn)收集三個復(fù)孔。3.2樣品保存于超低溫冰箱中。3.3從超低溫冰箱中取出樣品，放置于37度水浴鍋中進(jìn)行解凍。3.4樣品完全解凍后，迅速將其放置于液氮中3-5分鐘進(jìn)行速溶，再37度水浴至完全溶解。3.5反復(fù)凍融3次。IL12表達(dá)的檢測4.1相關(guān)試劑準(zhǔn)備試劑稀釋1XELISADiluent10ml5XDiluent加到40ml超純水中1XCoatingBuffer12ml10XCoatingBuffer加到108ml超純水中1XCaptureAntibody48ul250XCaptureAntibody加到12ml1XCoatingBuffer中1XDetectionAntibody48ul250XDetectionAntibody加到12ml1XELISADiluent中1XAvidin-HRP48ul250XAvidin-HRP加到12ml1XELISADiluent中1XTMBWorkingConcentrationStopSolution2NH2SO4WashBuffer1XPBS,0.05%Tween-204.2包被使用多通道移液器向Coster9018ELISA96孔板每孔中加入100ul1XCaptureAntibody，保鮮膜包裹后放入4度冰箱中，過夜。4.3洗板吸走孔中液體，清洗3次，每次每孔加入250ulWashBuffer，輕輕晃動板子1分鐘，吸走清洗液，吸水紙吸干殘余液體；4.4封閉每孔加入200ul1XELISADiluent，室溫放置1小時。4.5標(biāo)準(zhǔn)品稀釋取10ul標(biāo)準(zhǔn)品溶解于12ml1XELISADiluent中，得到濃度為500pg/ml，依照下表所示，共稀釋8個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，一次鋪板，每個濃度鋪3個復(fù)孔。500pg/ml250pg/ml125pg/ml62.5pg/ml31.75pg/ml15.875pg/ml7.9375pg/ml3.96875pg/ml10ul+12mlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500μlDiluent500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul500ul4.6樣品稀釋樣品使用1XELISADiluent進(jìn)行適當(dāng)稀釋（可預(yù)先摸索稀釋倍數(shù)），100ul/孔，每個樣品鋪3個復(fù)孔；4度過夜孵育。4.7洗板同4.3，洗3-5次。4.8孵育檢測抗體每孔加入100ul1XDetectionAntibody，室溫孵育1小時；同4.3洗板3-5次。4.9酶連反應(yīng)每孔中加入100ul1XAvidin-HRP，室溫孵育30分鐘m,同4.3洗板5-7次;每孔加入100ul1XTMB，室溫孵育15分鐘后，每孔加入50ulStopSolution。4.10讀板檢測450nm吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品IL12表達(dá)量。病毒活性檢測：試驗(yàn)：BioTTT001病毒活性檢測SOP（Cytopethiceffectassay）目的利用細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopethiceffectassay）檢測BioTTT001活性試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)Gibco10378-016-20度1%crystalvioletsolutionSigmaV5265室溫儀器設(shè)備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIESA2細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800SERIES試驗(yàn)過程1.細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板1.1復(fù)蘇JH293一支，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時進(jìn)行傳代。1.2傳代3-5次，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。1.3利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。1.4使用含10%FBS-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞溶度為1.0X105/ml，500ul/孔進(jìn)行鋪板。1.5將24孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。2.病毒感染2.1培養(yǎng)14-18小時，觀察細(xì)胞完全貼壁后，消化其中3個孔，分別進(jìn)行計數(shù)，取平均值。2.2感染BioTTT001及對照病毒，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，使用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒，每孔加500ul含病毒的無血清DMEM；鋪板如下：DoseBioTTT001對照病毒（dl1520）104VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2103VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2102VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2101VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2100VP/cell復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔1復(fù)孔2Mock復(fù)孔1復(fù)孔2復(fù)孔3復(fù)孔4病毒梯度稀釋：150ul150ul150ul150ul150ul150ul150ul150ul1000102101000102101103104Total2000ul1350ul1350ul1350ul1350ul2000ul無血清DMEM2.3細(xì)胞培養(yǎng)箱放置2小時，吸走含病毒培養(yǎng)基，500ul/孔PBS輕輕晃動清洗一次。2.4每個孔加入500ul10%FBS-DMEM培養(yǎng)基,放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天;3.結(jié)晶紫染色3.1吸走培養(yǎng)基，500ul/孔PBS洗一遍。3.2吸走PBS，300ul/孔4%甲醛溶液，室溫固定30分鐘。3.3吸走甲醛溶液，500ul/孔PBS洗一遍。3.4吸走PBS，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中烘干。3.5每孔滴加20ul結(jié)晶紫溶液，晃動板子，至孔底完全浸染結(jié)晶紫。3.6室溫放置30分鐘，1ml/孔PBS洗兩遍。3.7吸走PBS，烘干，拍照記錄。體外細(xì)胞殺傷復(fù)制能力檢測：試驗(yàn)1：BioTTT001體外細(xì)胞殺傷試驗(yàn)SOP目的檢測BioTTT001對靶細(xì)胞的殺傷能力試劑來源、配制及保存條件試劑來源/品牌貨號/配制存儲BioTTT001深圳S160324A-80度DMEMGibco75510-0194度FBSGEMINI900-108-20度Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)Gibco10378-016-20度MTSPROGEMAG111-20度PMS-20度儀器設(shè)備儀器品牌型號生物安全柜Thermo1300SERIESA2細(xì)胞培養(yǎng)箱Thermo3111超低溫冰箱ThermoFORMA8800SERIES酶標(biāo)儀BECKMANDTX880試驗(yàn)過程1.細(xì)胞培養(yǎng)及鋪板1.1復(fù)蘇HCPCI（敘利亞倉鼠頭頸部腫瘤細(xì)胞株）一支，待細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時進(jìn)行傳代。1.2傳代3-5次，觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，消化收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。1.3利用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。1.4使用含10%FBS-DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞溶度為2.22X104/ml，90ul/孔進(jìn)行鋪板（104/孔）。鋪板方式如下(PBS100ul/孔，2%Medium90ul/孔)：PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBS2%McellscellscellscellscellscellscellscellscellscellsPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS1.5將96孔板放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。2.病毒感染2.1培養(yǎng)14-18小時，觀察細(xì)胞完全貼壁。2.2感染BioTTT001，最高感染劑量為10000PFU/cell，使用2%FBS-DMEM培養(yǎng)基稀釋病毒，每孔加10ul含相應(yīng)病毒的2%FBS-DMEM；病毒梯度如下：10410310210110-110-210-310-4CtrlV+400μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M360μl2%M400μl2%M40u