抗體制備技術

抗體制備技術第1頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月引言概念抗體(antibody,Ab)是B細胞識別抗原后，增殖、分化為漿細胞所產生的一種蛋白質，主要存在于血清等體液中，能與相應抗原特異性結合。2第2頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月引言結構與類別3第3頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月引言應用領域4第4頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月引言人工抗體制備多克隆抗體（免疫血清）單克隆抗體基因工程抗體5第5頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月引言高質量的抗體應該具有高效價、高特異性及高親和性。制備高質量抗體就必須有理想的免疫原，適宜的動物和制定最佳的免疫方案。6第6頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備免疫原問題一：多克隆抗體制備第7頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月何謂免疫原？免疫原（immunogen)指用于制備抗體的抗原(antigen)或半抗原(hapten）；免疫原包括顆粒性抗原、可溶性抗原和人工修飾的抗原；8第8頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備顆粒性免疫原顆粒性免疫原包括：細胞性抗原：血細胞和組織細胞病原體：細菌、病毒、支原體等9第9頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備綿羊紅細胞采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調合適濃度10第10頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備細菌性免疫原培養(yǎng)細菌分離、鑒定離心、洗滌合適濃度擴大培養(yǎng)滅活處理11第11頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備可溶性免疫原組織勻漿破碎細胞提純目的蛋白酶消化處理超聲粉碎反復凍融12第12頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備可溶性免疫原提純目的蛋白選擇性沉淀凝膠層析離子交換層析親和層析13第13頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備可溶性免疫原層析技術層析柱紫外監(jiān)測收集器14第14頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備可溶性免疫原免疫原的鑒定純度蛋白含量免疫活性分子量15第15頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原人工免疫原經過人工修飾的半抗原稱之為人工免疫原。如：甾體類激素、小分子藥物等。將半抗原與蛋白載體連接，使之具有免疫原性，可用于制備免疫血清。16第16頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原用于連接的載體蛋白質類：白蛋白多肽聚合物：多聚賴氨酸大分子聚合物：羧甲基纖維素常用：BSA，OA17第17頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原修飾半抗原是需考慮：半抗原的溶解度和穩(wěn)定性;結合鍵的位置;選擇適合的偶聯(lián)試劑；18第18頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原含有氨基或羧基的半抗原與載體連接方法：碳化二亞胺法混合酸酐法戊二醛法形成穩(wěn)定肽鍵19第19頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原不含有氨基或羧基的半抗原需改造成帶有上述基團的衍生物，再通過上述方式連接：琥珀酸酐法可將帶有羥基的半抗原改造成帶羧基的半抗原。20第20頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備人工免疫原一般情況下：人工免疫原的制備是一個重要和復雜的工作；一種半抗原需同時連接兩種不同載體，便于半抗原抗體的檢測；21第21頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月關于佐劑的使用何謂“佐劑”佐劑（adjuvant）是指能夠增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，應用時可與抗原同時或預先注射于機體。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒有免疫原性。22第22頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月關于佐劑的使用佐劑種類：具有免疫原性抗酸桿菌（BCG）無免疫原性福氏佐劑氫氧化鋁常用：福氏佐劑23第23頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月福氏佐劑成分：羊毛脂液體石蠟BCG不完全佐劑完全佐劑24第24頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月福氏佐劑使用原則：顆粒性抗原一般情況下不需使用；可溶性大分子量的蛋白質免疫原、人工抗原，初次免疫時必須使用佐劑；不連續(xù)兩次使用完全福氏佐劑，以免導致動物嚴重反應；25第25頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備福氏佐劑-可溶性抗原復合物可溶性抗原福氏佐劑充分乳化研磨法與注射器混合法26第26頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇動物與免疫動物問題一:免疫血清的制備第27頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫血清與多克隆抗體28第28頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備免疫血清的程序獲得理想免疫原選擇免疫動物確定免疫方案實施免疫程序檢測抗體效價采血分離血清抗體純化鑒定29第29頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月如何選擇免疫動物原則：免疫原與動物種屬關系；動物個體狀況的選擇；抗原性質與動物種類；抗血清用量和要求；30第30頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月如何選擇免疫動物家兔是最常用的免疫動物山羊、綿羊馬、駱駝31第31頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月動物飼養(yǎng)做好標記細心觀察做好記錄精心喂養(yǎng)32第32頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫方案免疫原用量免疫途徑次數(shù)與間隔時間33第33頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫方案之一：全量免疫法足掌皮下接種福氏完全佐劑-抗原（l～10mg）背部皮下接種福氏不完全佐劑-抗原（l～10mg），并重復3-4次，間隔1周肌肉、腹腔或靜脈加強免疫（l～10mg）1周1周34第34頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫方案之二：微量免疫法足掌皮下接種BCG（10～20mg）腘窩淋巴結注射福氏完全佐劑-抗原（0.1～0.2mg）肌肉或靜脈加強免疫（0.4～0.6mg）1周1周35第35頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月如何測定抗體效價顆粒性抗原免疫原性強，抗體效價高，可采用凝集實驗測定。可溶性抗原采用沉淀反應或其它標記免疫技術測定。36第36頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月如何測定抗體效價ELISA是常用技術之一37第37頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備單克隆抗體的理論基礎問題二:單克隆抗體制備第38頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆選擇學說1857年，F(xiàn)MBurnet提出克隆選擇學說。指出：每個B淋巴細胞表面的抗原受體只識別一種抗原表位，并產生針對該決定簇的抗體。39第39頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆選擇學說40第40頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆選擇學說淋巴細胞不能在體外長期存活41第41頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交瘤技術雜交瘤細胞繼承兩個親本細胞特性42第42頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交瘤技術的創(chuàng)始人43第43頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交瘤技術1984榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎雜交瘤技術是制備抗體的技術革命44第44頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交瘤技術的基本原理問題二:單克隆抗體制備第45頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月兩個基本問題選擇親本細胞與細胞融合應用選擇培基與雜交瘤細胞篩選46第46頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月親本細胞之一：免疫脾細胞被抗原致敏的B淋巴細胞，可分化為漿細胞并分泌免疫球蛋白；單一B細胞克隆表達一種抗原受體，識別并結合一種抗原表位，分泌單一特異性抗體；47第47頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月親本細胞之一：免疫脾細胞采用BALB/c小鼠48第48頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月親本細胞之二：骨髓瘤細胞選擇有HGPRT或TK缺陷的細胞株；能與B細胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細胞，并分泌免疫球蛋白；骨髓瘤細胞本身不分泌免疫球蛋白；具有較高融合效率；49第49頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月親本細胞之二：骨髓瘤細胞SP2/0細胞NS1細胞容易培養(yǎng)傳代，一般培養(yǎng)基即可，無特殊要求。50第50頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月親本細胞之二：骨髓瘤細胞Sp2/0為懸浮型細胞51第51頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞融合52第52頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞融合化學法物理法生物法PEG（聚乙二醇）為最常用的融合法53第53頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇培養(yǎng)基基本成分次黃嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）HAT選擇培養(yǎng)基54第54頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇培養(yǎng)基作用原理為何使用選擇培養(yǎng)基？55第55頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇培養(yǎng)基作用原理56第56頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇培養(yǎng)基作用原理57第57頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月雜交瘤技術的實驗流程問題二:單克隆抗體制備第58頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程59第59頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程60第60頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程制備免疫脾細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞細胞融合克隆篩選克隆化細胞鑒定大量制備61第61頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月技術要點免疫脾細胞的制備骨髓瘤細胞的培養(yǎng)與篩選細胞融合陽性克隆的篩選克隆化大量抗體的制備62第62頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備脾細胞選擇合適的免疫方案是獲得高質量的抗體的前提；一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫；免疫方案應根據(jù)抗原的特性不同而定；

63第63頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月制備脾細胞64第64頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)篩選骨髓瘤細胞SP2/0細胞為腫瘤細胞，易發(fā)生突變喪失酶的缺陷；為確保SP2/0細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8-AG(8氮鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變；65第65頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)篩選骨髓瘤細胞+8-AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells66第66頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)篩選骨髓瘤細胞使用對數(shù)生長期細胞，融合前進行換液，確保細胞處于最佳狀態(tài)。培基：RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％。一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞。67第67頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞融合FUSIONPEGMYELOMACELLSSPLEENCELLSHYBRIDOMACELLSELISAPLATEFeederCellsGrowthMediumHATMediumPlatingofCellsinHATselectiveMediumScanningofViableHybridomas68第68頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞融合雜交瘤技術中最為關鍵一步；融合前親本細胞需經預處理；融合37℃水浴中進行；注意兩種親本細胞的比例；選擇高質量細胞融合劑；緩慢終止融合作用；69第69頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月關于“PEG”分子量1500-3000道爾頓；誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合；不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同；應用濃度為50%；70第70頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月挑選陽性克隆細胞生長至一定數(shù)量后便可進行；方法應敏感、簡單、重復性好；方法：

RIA、ELISA、FIA；71第71頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月挑選陽性克隆ELISA是常用技術之一72第72頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月克隆化將陽性克隆與其它克隆分開的過程。克隆化應及早進行，以防止陽性克隆丟失。方法有：顯微操作法有限稀釋法軟瓊脂法

73第73頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月應用有限稀釋法進行克隆化不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法74第74頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月細胞鑒定特異性Ig類與亞類中和活性染色體核型識別抗原表位親和力75第75頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月大量制備抗體體外細胞培養(yǎng)腹腔內培養(yǎng)76第76頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月大量制備抗體腹腔內培養(yǎng)77第77頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程體外細胞培養(yǎng)78第78頁，課件共90頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗流程注意：陽性