核酸的分離純化

核酸的分離純化第1頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA和RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學(xué)和分子診斷的研究對(duì)象DNA和RNA的分離純化是分子生物學(xué)研究及分子診斷最基礎(chǔ)的工作第2頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸分離純化的原則:保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性盡可能提高核酸制品的純度第3頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子提取的技術(shù)路線I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第4頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)基因組DNA的分離純化第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化第四節(jié)RNA的分離純化第五節(jié)核酸的保存與鑒定第5頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則

第6頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存第7頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）材料與方法的選擇

不同的研究目的對(duì)核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度有不同的要求。需考慮制備核酸所需的時(shí)間與成本應(yīng)選擇安全的試劑與制備方案一、材料與方法的選擇第8頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

1.保持核酸堿基序列的完整性

2.盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度

3.保持核酸的完整性

盡量簡(jiǎn)化分離純化步驟，縮短提取時(shí)間

盡量避免各種有害因素對(duì)核酸的破壞（二）選擇原則一、材料與方法的選擇第9頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌第10頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）核酸的釋放

DNA和RNA均位于細(xì)胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細(xì)胞、釋放核酸。第11頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第12頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

應(yīng)該清除的雜質(zhì)主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白質(zhì)、多糖及脂類(lèi)物質(zhì)等

2.非需要的核酸分子分離某一核酸分子時(shí)，其它核酸皆為雜質(zhì)

3.加入的有機(jī)溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化第13頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸最常用的方法常用的鹽類(lèi):醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機(jī)溶劑:乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%～75%的乙醇洗滌去除第14頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存第15頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）核酸的鑒定1.濃度鑒定2.純度鑒定3.完整性鑒定第16頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月紫外分光光度法：核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，可以吸收紫外線，其最大吸收波長(zhǎng)為260nm。

1.濃度鑒定第17頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

各種堿基的紫外吸收光譜第18頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌入堿基平面后，本身無(wú)熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。熒光強(qiáng)度的積分與溶液中核酸的含量呈正比。第19頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月EB與DNA的結(jié)合第20頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第21頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

紫外分光光度法：主要通過(guò)A260與A280的比值來(lái)判定有無(wú)蛋白質(zhì)的污染。比值升高或降低均提示制備的核酸純度不佳。

2.純度鑒定第22頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0第23頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月熒光光度法：

EB等熒光染料示蹤的核酸電泳可判定核酸制品的純度。第24頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳可判定核酸制品的完整性基因組DNA如果發(fā)生降解，電泳圖呈拖尾狀

3.完整性鑒定第25頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA的降解第26頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強(qiáng)度應(yīng)呈特定的比值。沉降系數(shù)大，電泳遷移率低，熒光強(qiáng)度高沉降系數(shù)小，電泳遷移率高，熒光強(qiáng)度低

第27頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月28S（或23S）RNA的熒光強(qiáng)度一般約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解若在點(diǎn)樣孔附近有著色條帶，提示可能存在DNA的污染第28頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第29頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）核酸的保存

1.DNA的儲(chǔ)存2.RNA的儲(chǔ)存第30頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

溶于TE緩沖液中的DNA在-70℃冰箱可保存數(shù)年。

TE的pH為8.0時(shí)，DNA的脫氨反應(yīng)減少，pH低7.0時(shí)DNA易變性。

1.DNA的保存第31頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2.RNA的保存

RNA溶于H2O或0.3mol/L的NaAc溶液中，-70℃

保存

RNA溶液中加入RNasin或VRC，可延長(zhǎng)保存時(shí)間用于配置試劑及溶解RNA的H2O均應(yīng)經(jīng)DEPC處理第32頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)真核基因組DNA的分離純化

第33頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離粗分離前處理離子交換層析純化有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法

哺乳動(dòng)物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線第34頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基因組DNA的提取

酚抽提法樣品的準(zhǔn)備細(xì)胞的裂解蛋白質(zhì)變性DNA的抽提DNA的沉淀第35頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月血基因組DNA試劑盒酵母基因組DNA試劑盒細(xì)菌基因組DNA試劑盒細(xì)胞基因組DNA試劑盒第36頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收第37頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

一、酚抽提法1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，現(xiàn)在使用的是改進(jìn)的方法以含EDTA、SDS及RNase的裂解緩沖液裂解細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提，獲得DNA粗制品第38頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第39頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、甲酰胺解聚法

1987年Kupiec等報(bào)道了甲酰胺解聚法，其中細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)水解步驟同酚抽提法，但不進(jìn)行酚的抽提。第40頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

三、玻棒纏繞法玻棒纏繞法是在Bowtell(1987)方法的基礎(chǔ)上經(jīng)改進(jìn)而來(lái)第41頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、其它方法

有些分子診斷技術(shù)并不需要高分子量的DNA樣品，因此步驟簡(jiǎn)化、操作簡(jiǎn)便的DNA快速提取法廣泛使用。

1.異丙醇沉淀法

2.玻璃珠吸附法第42頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、DNA片段的純化常用的純化方法：有機(jī)溶劑抽提法柱層析法（columnchromatography）第43頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第44頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六、DNA片段的回收原則與要求:

1.提高片段的回收率

2.清除回收的DNA樣品中的雜質(zhì)第45頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段第46頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠挖塊回收法

（一）從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段第47頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段標(biāo)準(zhǔn)方法是壓碎與浸泡法。費(fèi)時(shí)但操作簡(jiǎn)單，是小片段DNA回收的較好方法。第48頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)質(zhì)粒DNA的提取與純化

第49頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒是細(xì)菌內(nèi)獨(dú)立于染色體并能自我復(fù)制的小環(huán)狀DNA分子其大小范圍從lkb至200kb以上不等已經(jīng)在形形色色的細(xì)菌類(lèi)群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，而質(zhì)粒的分離與提取則是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第50頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第51頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒特性1.分子相對(duì)小2.含有高效的自主復(fù)制成分3.不相容性4.轉(zhuǎn)移性5.選擇的標(biāo)記6.限制性?xún)?nèi)切酶單一切。第52頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA的提取和純化1．細(xì)菌的培養(yǎng)

先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA的小量制備2-5ml質(zhì)粒DNA的大量制備500ml{第54頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2．細(xì)菌的收集細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質(zhì)粒DNA的純度，離心棄上清，細(xì)菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應(yīng)該仔細(xì)去除干凈

第55頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月 堿裂解法 煮沸法

SDS裂解法

Triton-溶菌酶法3．細(xì)菌的裂解方法4．質(zhì)粒DNA的提取

適用于大質(zhì)粒DNA

不適宜含糖高的菌株如HB101第56頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其他方法一、堿裂解法五、質(zhì)粒DNA的純化第57頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、堿裂解法

在強(qiáng)堿（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。第58頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞裂解后，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物當(dāng)pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋結(jié)構(gòu)在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質(zhì)粒DNA保留在上清液中第59頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第60頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、煮沸裂解法

將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。第61頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA,然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA第62頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁用SDS裂解去壁細(xì)胞，溫和釋放質(zhì)粒到等滲液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA第63頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由于條件溫和，SDS裂解法特別適用于大質(zhì)粒DNA（>15kb）的提取。但由于部分質(zhì)粒DNA會(huì)與細(xì)胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。第64頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、其他方法（二）牙簽少量制備法(一)小量一步提取法第65頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月直接將酚/氯仿與細(xì)菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA，最后從上清液中回收質(zhì)粒DNA簡(jiǎn)單快捷、成本低，提取的質(zhì)?？捎糜谙拗菩?xún)?nèi)切酶圖譜分析(一)小量一步提取法第66頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）牙簽少量制備法用牙簽直接挑取生長(zhǎng)在瓊脂平板上的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA由于制備的質(zhì)粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學(xué)反應(yīng)，但可用于質(zhì)粒的鑒定第67頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月五、質(zhì)粒DNA的純化１.CsCl-EB法２.聚乙二醇沉淀法３.柱層析法第68頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

在過(guò)量EB存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開(kāi)。蛋白質(zhì)由于密度小而浮于液面RNA密度大而沉于管底各種DNA密度介于蛋白質(zhì)與RNA之間，處于中部EB-CsCl密度梯度離心法第69頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第70頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月不同分子構(gòu)型的DNA與EB的結(jié)合能力不同，密度下降也不同，因而可將它們有效分離開(kāi)。

染色體DNA、開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA等可嵌入更多的EB，因而密度下降較多

閉環(huán)質(zhì)粒DNA為超螺旋三級(jí)結(jié)構(gòu)，EB不易插入而結(jié)合量少，密度下降較少

第71頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第72頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)真核細(xì)胞RNA的分離純化

第73頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞RNA的含量

每個(gè)細(xì)胞的RNA量約為10-5

μg80%-85%rRNA10%-15%tRNA1%-5%mRNA

其他RNA：hnRNA、snRNA、snoRNA…第74頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

三、商品化試劑單相裂解法

四、mRNA的分離純化一、RNA制備的條件與環(huán)境第75頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、RNA制備的條件與環(huán)境RNA易被RNase水解，RNase除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周?chē)沫h(huán)境中RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)第76頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月去除RNase的污染和抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活細(xì)胞內(nèi)RNase的活性第77頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強(qiáng)烈的胍類(lèi)變性劑）使用蛋白酶K使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉第78頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對(duì)RNA