離子交換層析

離子交換層析2023/7/161第1頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換層析的概念

離子交換層析是利用分離物（蛋白質(zhì)）表面的荷電的離子或基團(tuán)與帶相反電荷的不溶性基質(zhì)（離子交換劑）進(jìn)行可逆的交換。更確切地，是先用蛋白質(zhì)偶極離子置換基質(zhì)官能團(tuán)上的平衡離子（反離子），然后蛋白質(zhì)本身又隨著平衡離子的比例的增加而被置換下來(lái)。根據(jù)蛋白質(zhì)各組分所帶電荷的性質(zhì)及電荷量的差異，被置換的速度不同而在層析過(guò)程中達(dá)到分離。2023/7/162第2頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2023/7/163第3頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié) 基本原理1.離子交換劑2.交換反應(yīng)3.原理4.離子交換劑與離子結(jié)合的關(guān)系5.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力2023/7/164第4頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。2023/7/165第5頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

纖維素－O－CH2－COO一—Na+

基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子

羧甲基纖維素離子交換劑組成示意圖1.離子交換劑

（1）離子交換劑：即是通過(guò)化學(xué)鍵合的方法向惰性支持物上連接可解離的化學(xué)基團(tuán)后的產(chǎn)物。由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或功能基團(tuán)）和反離子構(gòu)成。2023/7/166第6頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陰離子交換劑與陽(yáng)離子交換劑的基本構(gòu)成：

基質(zhì)－電荷基團(tuán)－反離子（反離子基團(tuán)）陰離子交換劑陽(yáng)離子交換劑2023/7/167第7頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RA+B+

RB+A+

RA代表陽(yáng)離子交換劑，它在溶液中解離出來(lái)的陽(yáng)離子A+與溶液中的陽(yáng)離子B+能發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。2.交換反應(yīng)2023/7/168第8頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換反應(yīng)：R-A++B+R-B++A+平衡常數(shù)表示離子交換劑對(duì)溶液中不同離子的親和力：[A][B]AB[RB][RA]++K

=[A]=[B]KA

B=[RB][RA]++KAB=1[RA]＞[RB]KAB＞1[RA][RB]KAB1＜＜[RB]=[RA]2023/7/169第9頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月KAB值反映離子交換劑對(duì)不同離子的親合力或選擇性的參數(shù)，稱KAB值為離子交換劑對(duì)A+和B+的選擇系數(shù)。2023/7/1610第10頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.離子交換層析的原理利用蛋白質(zhì)及欲分離的生物分子帶電性質(zhì)的差異為分離依據(jù)；帶電荷的蛋白質(zhì)樣品可以與離子交換劑的帶正電荷或負(fù)電荷的基團(tuán)結(jié)合；蛋白質(zhì)樣品同離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的靜電吸引力，pH影響這種吸引力；蛋白質(zhì)的洗脫通過(guò)改變洗脫液的鹽離子強(qiáng)度和pH來(lái)完成。2023/7/1611第11頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而以不同牢度被吸附于離子交換劑上，通過(guò)改變離子強(qiáng)度或(和)pH使大分子再?gòu)碾x子交換劑上先后被洗脫下來(lái)。2023/7/1612第12頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月混合樣品帶負(fù)電荷，與陰離子交換劑結(jié)合。

樣品堿性較弱，吸附力較弱，用低濃度鹽洗脫。樣品堿性強(qiáng)，與交換劑結(jié)合牢，解脫難。用高濃度鹽洗脫。

各樣品帶電荷不同，與離子交換劑的結(jié)合能力不同。依解離的難易的差異，而達(dá)到分離。2023/7/1613第13頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換層析示意圖2023/7/1614第14頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Whathappensinionexchange?SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------2023/7/1615第15頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Whathappensinionexchange?Equilibration++++++-------anionexchangebead2023/7/1616第16頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Whathappensinionexchange?Sampleapplicationandwash-----------++++++----2023/7/1617第17頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Whathappensinionexchange?Elution----------------------------------++++++++++++--2023/7/1618第18頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Whathappensinionexchange?Regeneration-----------------------++++++2023/7/1619第19頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.離子交換劑與離子結(jié)合的關(guān)系強(qiáng)酸性離子交換劑、強(qiáng)堿性離子交換劑對(duì)各種反離子的結(jié)合與否以及結(jié)合力的強(qiáng)弱遵循一定的規(guī)律；并對(duì)樣品選擇離子交換劑、洗脫液離子類型、pH狀態(tài)都至關(guān)重要。離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力是與離子的電荷量成正比，與水合離子的半徑的平方成反比關(guān)系。2023/7/1620第20頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑在溶液中與水合離子結(jié)合能力的趨勢(shì)結(jié)論：離子價(jià)數(shù)愈高，結(jié)合力愈大。離子間電荷相同時(shí)，離子的原子序數(shù)愈高，水合離子半徑愈小，結(jié)合力愈大。故元素周期表中離子結(jié)合力的趨勢(shì)的方向?yàn)椋簭男≈链蟆?P71表5-1)2023/7/1621第21頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5.兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力蛋白質(zhì)、酶、多肽、核苷酸及核酸等兩性電解質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合力取決于其本身的物理化學(xué)性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。當(dāng)pH﹤pI,帶正電荷，被陽(yáng)離子交換劑吸附。pH﹥pI,帶負(fù)電荷，被陰離子交換劑吸附。pI離pH愈遠(yuǎn)，分離物所帶電荷越強(qiáng)，越容易被離子交換劑吸附，吸附力強(qiáng)，越難解吸附。2023/7/1622第22頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2023/7/1623第23頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)離子交換劑的基本要求：1.高度的不溶性；

2.多孔的結(jié)構(gòu)，巨大的表面積；

3.豐富的交換基團(tuán)；

4.穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。2023/7/1624第24頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、分類A.陽(yáng)離子交換劑是在不溶性載體上,結(jié)合有中性pH下帶負(fù)電荷的官能團(tuán)（羧甲基或磺丙基基團(tuán)）。這類樹脂適合于分離等電點(diǎn)在中性以上的蛋白質(zhì)。三角形代表負(fù)電荷的官能團(tuán)，釋放的反離子帶正電荷。+--+++--2023/7/1625第25頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月陰離子交換劑帶正電荷官能團(tuán)，反離子帶負(fù)電荷。B.陰離子交換劑的官能團(tuán)（二乙氨乙基DEAE或季氨堿QAE）樹脂在中性pH條件帶正電荷。釋放的反離子帶負(fù)電荷，在中性pH時(shí)能與酸性蛋白質(zhì)相互作用。+__++_2023/7/1626第26頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換樹脂的基本類型陽(yáng)離子交換劑強(qiáng)酸性弱酸性陰離子強(qiáng)堿性交換劑弱堿性交換基團(tuán)磺酸基羧酸基季銨基伯、仲銨基交換離子-SO3H-COOH-NH3-NHR、-NH2工作范圍（pH）1～147～140～120～7水解穩(wěn)定性穩(wěn)定易水解穩(wěn)定易水解離子吸附速度

大H型小

大OH型小2023/7/1627第27頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月請(qǐng)記?。宏?yáng)離子交換劑本身帶酸性基團(tuán)，在其pK以上荷負(fù)電。陽(yáng)離子分為：強(qiáng)酸性、中強(qiáng)酸性、弱酸性陰離子交換劑本身帶堿性基團(tuán)，在其pK以下荷正電。陰離子分為：強(qiáng)堿性、中強(qiáng)堿性、弱堿性2023/7/1628第28頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.疏水性離子交換劑疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是人工合成的、與水結(jié)合力較小的物質(zhì)，稱為樹脂。其基質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)是苯乙烯和二乙烯苯合成呈網(wǎng)狀的聚合體，引入不同的電荷基團(tuán)。2023/7/1629第29頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月疏水性離子交換劑具有如下特性而被廣泛應(yīng)用：

大量的活性基團(tuán)較高的交換容量良好的機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)均勻的球形顆粒、型號(hào)齊全以及豐富的產(chǎn)品2023/7/1630第30頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.親水性離子交換劑

親水性離子交換劑的基質(zhì)是一類天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。有：纖維素Sephacel、交聯(lián)葡聚糖Sephadex

交聯(lián)瓊脂糖Sepharose2023/7/1631第31頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）纖維素Sephacel離子交換劑基本結(jié)構(gòu):

以微晶纖維素為基質(zhì)，化學(xué)方法引入電荷基團(tuán)，構(gòu)成各種陽(yáng)離子、陰離子交換劑;示弱陰離子樹脂的結(jié)構(gòu)（DEAE-Sephacel）BeadedCellulose-O-CH2-CH2N+-H-Cl-CH2CH3CH2CH32023/7/1632第32頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1633第33頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2)交聯(lián)葡聚糖Sephadex離子交換劑以交聯(lián)葡聚糖G－25和G－50為基質(zhì)，化學(xué)法引入電荷基團(tuán)構(gòu)成各種陰離子、陽(yáng)離子交換劑。（DEAE-Sephadex、QAE-Sephadex）。DEAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-QAE-Sephadex-O-CH2-CH2-N+-CH2-CH(OH)-CH3-Cl-CH2CH3CH2CH3CH2CH3CH2CH32023/7/1634第34頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/7/1635第35頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3)瓊脂糖Sepharose離子交換劑以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B為基質(zhì)，化學(xué)法引入電荷基團(tuán)構(gòu)成陽(yáng)離子交換劑CM－SepharoseCL-6B和陰離子交換劑DEAE-SepharoseCL-6B。CM(SepharoseCl-6B)-O-CH2-C-02Na+DEAE-SepharoseCl-6B-O-CH2-CH2-N+-H-Cl-CH2-CH3CH2-CH32023/7/1636第36頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月親水性離子交換劑的結(jié)構(gòu)瓊脂糖離子交換劑的基本結(jié)構(gòu)以交聯(lián)瓊脂糖CL－6BSepharose為基質(zhì)。其網(wǎng)孔的大小通過(guò)交聯(lián)劑的比例調(diào)節(jié)，適合分離各種不同分子量的物質(zhì)。2023/7/1637第37頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity19952023/7/1638第38頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度3.吸水量或膨脹度4.交換容量5.穩(wěn)定性6.比重7.流速2023/7/1639第39頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求，調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種（篩孔）型號(hào)的交換劑。3.吸水量與膨脹度：是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積，即篩孔中所占的體積（Vi）。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、電荷基團(tuán)及交聯(lián)度的影響。4.交換容量：離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。2023/7/1640第40頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑的膨脹度與離子強(qiáng)度的關(guān)系1）在相同離子強(qiáng)度的條件時(shí),膨脹度隨著基質(zhì)的交聯(lián)度的增加而降低。2）在相同離子強(qiáng)度的條件時(shí)，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型的離子交換劑的膨脹度大，弱酸、弱堿的膨脹度小。說(shuō)明前者的解離度達(dá)最大，帶電荷基團(tuán)之間的排斥力大，結(jié)果膨脹度亦大。2023/7/1641第41頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pH對(duì)離子交換劑膨脹度的影響弱陽(yáng)離子交換劑的膨脹度隨著pH的增高而增大弱陰離子交換劑的膨脹度隨著pH的降低而增大弱離子交換劑在其近pK值時(shí)的pH中膨脹度最小交聯(lián)度大的或帶強(qiáng)電荷基團(tuán)的離子交換劑，其膨脹度基本與pH的變化無(wú)關(guān)2023/7/1642第42頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑的性質(zhì)1.顏色與形狀2.交聯(lián)度:離子交換劑的基質(zhì)的交聯(lián)度根據(jù)適用的要求，調(diào)節(jié)交聯(lián)劑在基質(zhì)中的比例或百分濃度而制成各種（篩孔）型號(hào)的交換劑。3.吸水量與膨脹度：是指離子交換劑在水溶液中吸取的體積，即篩孔中所占的體積（Vi）。吸水量與膨脹度受基質(zhì)的性質(zhì)、離子強(qiáng)度、pH、電荷基團(tuán)及交聯(lián)度的影響。4.交換容量：離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。2023/7/1643第43頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月交換容量的影響因素篩孔：篩孔的直徑與分離物的分子量大小密切相關(guān)。(表P76)離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度的增加引起對(duì)交換劑上結(jié)合蛋白質(zhì)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，而降低交換容量，在解離中便利用逐漸加大離子強(qiáng)度的原理。2023/7/1644第44頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月pH與交換容量的關(guān)系弱陰離子交換劑的交換容量是隨著pH的下降而增大弱陽(yáng)離子交換劑的交換容量是隨著pH的上升而增大強(qiáng)陰離子與強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑的交換容量基本與pH變化無(wú)關(guān)，因其完全呈解離狀態(tài)，始終很高2023/7/1645第45頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月交換容量的影響因素若加樣量超過(guò)樹脂的容量，寶貴的活性會(huì)隨著未吸附的物料一起流失；若樹脂過(guò)量，會(huì)大大減少活性物質(zhì)的回收。測(cè)定實(shí)驗(yàn)：2023/7/1646第46頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意交換容量包含樣品中的總蛋白量，而非僅僅是活性蛋白。各種蛋白樣品與樹脂的交換容量是不同的，應(yīng)分別測(cè)定。放大實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)留一定的結(jié)合空間，并使之在最小量。2023/7/1647第47頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月最佳上樣pH的選擇pH5.05.56.06.57.09.0+SSSSSS4℃,30～60min搖勻，充分結(jié)合＋＋＋＋＋＋＋

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在低的pH時(shí)，蛋白質(zhì)未結(jié)合，上清有活性，隨著pH的上升，蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合愈多，直至完全結(jié)合，上清中再檢測(cè)不到活性。+－離心，檢測(cè)上清的活性最佳上樣時(shí)高于緩沖液一個(gè)pH2023/7/1648第48頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5穩(wěn)定性：都具有理化穩(wěn)定性。6比重：7流速：2023/7/1649第49頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2023/7/1650第50頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)操作一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型二、緩沖液的選擇三、分離物質(zhì)的交換四、程序2023/7/1651第51頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、離子交換劑的選擇、處理與轉(zhuǎn)型被分離物質(zhì)帶正電荷，選擇陽(yáng)離子交換劑；被分離物質(zhì)帶負(fù)電荷，選擇陰離子交換劑；被分離物質(zhì)為兩性離子，依據(jù)其在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)所帶電荷選擇交換劑。

陰離子交換劑結(jié)合帶陽(yáng)離子交換劑結(jié)合帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)正電荷的蛋白質(zhì)2023/7/1652第52頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①對(duì)于已知pI的物質(zhì)：在高于其等電點(diǎn)的pH，用陰離子交換劑；在低于其等電點(diǎn)的pH，用陽(yáng)離子交換劑。②對(duì)于未知pI的物質(zhì)：可參照電泳的結(jié)果，在中性或偏堿性的條件下進(jìn)行電泳，向陽(yáng)極移動(dòng)較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附；向陰極移動(dòng)或向陽(yáng)極移動(dòng)較慢的，可被陽(yáng)離子交換劑吸附。2023/7/1653第53頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑的選擇的原則★分離生物大分子一般采用親水性基質(zhì)。具有可人工控制的分子篩，及較多的可交換的基團(tuán)；★分離酶、核酸、蛋白質(zhì)等采用弱性的離子交換劑。其交換容量大，親水性，對(duì)生物樣品的穩(wěn)定性好，易發(fā)生結(jié)合；★洗脫液的pH與被分離物的pI至少相差一個(gè)pH值，才能將各種成份分開。pH﹥pI一個(gè)單位時(shí)選擇陰離子交換劑；pH﹤pI一個(gè)單位時(shí)選擇陽(yáng)離子交換劑。2023/7/1654第54頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑的選擇的原則例：。pI＝5.2的物質(zhì)在不同的pH條件下帶電荷性質(zhì)、帶凈電荷量不同，而能分別與陽(yáng)離子、陰離子交換劑結(jié)合。實(shí)驗(yàn)上選擇陰離子，因?yàn)閺膒H6.2－8.5條件溫和。不影響生物樣品活性；選擇陽(yáng)離子時(shí)，pH從4.2－3.0，條件極端，可能使樣品失去活性。2023/7/1655第55頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型目的：要求其帶上使用時(shí)所期望的離子或基團(tuán)。處理步驟：先用水浸泡至充分膨脹即可進(jìn)行處理。除細(xì)顆粒酸堿浸泡水洗滌堿或酸處理水洗滌緩沖液平衡再生：通過(guò)酸堿反復(fù)處理或借助轉(zhuǎn)型處理完成。轉(zhuǎn)型：指離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過(guò)程，轉(zhuǎn)型后的離子交換劑會(huì)按使用要求帶上一定種類的離子或基團(tuán)。除雜質(zhì)：P84表5-92023/7/1656第56頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

為什么金屬離子(Na+、K+等)可以吸附在H-型強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱上，而后又可以用HCl來(lái)再生強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱?

親和力大小不僅與離子性質(zhì)有關(guān)，而且與其濃度有關(guān)。前者根據(jù)一價(jià)金屬離子的親和力順序不難理解，而后者是采用高濃度HCl來(lái)再生強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換柱。2023/7/1657第57頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、緩沖液的選擇

離子交換劑吸附被分離物的量與緩沖液的pH值和離子濃度有密切關(guān)系。起始緩沖液：pH值一般比有效成分的pI值高一個(gè)單位或低一個(gè)單位，離子強(qiáng)度為0.1。洗脫液：離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來(lái)。一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高，pH值是隨著離子交換劑性質(zhì)變化而變化。2023/7/1658第58頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、交換動(dòng)態(tài)法---柱層析法：交換效率高，應(yīng)用廣泛。適合于制備、純化及分析。適用于實(shí)驗(yàn)室、科研，教學(xué)以及模型的建立；靜態(tài)法---可以大容器：盆、缸、桶、罐等操作。樣品液與交換劑進(jìn)行混合、攪拌、吸附，濾去上清液，再解吸附，濃縮。適合工廠，生產(chǎn)車間，產(chǎn)品的中試。其操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)陋，快速定性等優(yōu)勢(shì)。2023/7/1659第59頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、程序填裝柱子柱子平衡加入樣品開始洗脫分步收集定性檢測(cè)合并峰值濃縮樣品除去鹽離子定量分析計(jì)算回收率及純化倍數(shù)再生2023/7/1660第60頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子交換劑層析裝置（梯度洗脫配置）2023/7/1661第61頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.裝柱與加樣量樣品的準(zhǔn)備樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前以離心法除去。2.洗脫原則：增加離子強(qiáng)度、改變pH值方式：梯度洗脫（Gradientelution）階段洗脫(Stepwiseelution)2023/7/1662第62頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

2023/7/1663第63頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫曲線p86鹽濃度吸收曲線2023/7/1664第64頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月離子強(qiáng)度非線性梯度(階梯式洗脫曲線)2023/7/1665第65頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響梯度洗脫速率變化的因素A：當(dāng)CA、CB

的濃度確定后，總體積V越小，梯度速率變化越快。ABB：當(dāng)體積V確定時(shí)，CB－CA差值越大，梯度速率變化越快。0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1Vt1Vt22023/7/1666第66頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月比較線性梯度與階梯式梯度洗脫顯示：在樣品組分、柱子規(guī)格、緩沖液成份、洗脫速度相似的條件時(shí)，其分辨率有差異。但并未表現(xiàn)明顯優(yōu)勢(shì)。依據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)分離物各組分差異較小時(shí)，選用線性梯度；差異較大則選用階梯式梯度，以減小體積和節(jié)省時(shí)間。2023/7/1667第67頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A.C.相同條件的線性梯度

A.流速8毫升/小時(shí)，C為20毫升/小時(shí)；

B與A的流速相同，離子梯度不同

結(jié)果：三者顯示分辨率不同的結(jié)果線性梯度、洗脫速度與分辨率2023/7/1668第68頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月梯度圖的分析當(dāng)緩沖液的pH﹥pI（樣品）時(shí)，樣品帶負(fù)電荷，結(jié)合到陰離子交換劑，解吸附時(shí)，將pH下降，越來(lái)越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹤pI,樣品電荷由－0＋。樣品解離。A為陰離子交換劑。pH從10－7.5，變化。當(dāng)緩沖液的pH﹤pI（樣品）時(shí)，樣品帶正電荷，結(jié)合到陽(yáng)離子交換劑，解吸附時(shí)，將pH上升，越來(lái)越靠近pI，直至其pI、甚至pH﹥pI,樣品電荷由＋0－。樣品解離。B為陽(yáng)離子交換劑。pH從4.5－8.9變化。AB2023/7/1669第69頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容提要第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 離子交換劑的分類與性質(zhì)第三節(jié)操作第四節(jié)應(yīng)用2023/7/1670第70頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月去離子水的制備自來(lái)水過(guò)濾R-SO3H柱RN(CH3)3OH柱去離子水

混合柱RN(CH3)3OH柱1.水處理2023/7/1671第71頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

交換柱的填充樹脂一般采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂和強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂，如001×7(732#)和201×7(717#)；由于交換容量不同，實(shí)驗(yàn)中通常采用一根陽(yáng)離子交換柱和二根陰離子交換柱?；旌现矐?yīng)按等交換容量比例混合；混合柱的作用：由于離子交換是可逆反應(yīng)，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱和陰離子交換柱處理的去離子水，還存在著微量未交換的離子。若讓它再通過(guò)混合柱，由于兩種交換過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，離子交換后生成的H+和OH?結(jié)合成水而除去，進(jìn)一步提高了水的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室精制去離子水可采用

5cm×100cm混合柱處理一次去離子水。2023/7/1672第72頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.分離純化小分子物質(zhì)

離子交換層析廣泛應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。2023/7/1673第73頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核苷酸的解離性質(zhì)（pK）核苷酸磷酸基一級(jí)解離氨基磷酸基二級(jí)解離pIAMP0.93.76.22.35GMP0.72.46.11.55CMP0.84.56.32.66UMP1.0__6.4__見圖P88的分離圖譜2023/7/1674第74頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.分離純化生物大分子物質(zhì)

離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來(lái)進(jìn)行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。用離子交換層析制備、純化電荷量不同的生命物質(zhì)時(shí)，不但被分離物的活性可以保存，而且分辨率較高。2023/7/1675第75頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月各蛋白質(zhì)樣品的等電點(diǎn)BSApI=4.7糜蛋白酶pI=8.8胰蛋白酶pI=8.1細(xì)胞色素CpI=9.8～10.12023/7/1676第76頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pH