細(xì)菌病毒培養(yǎng)技術(shù)

細(xì)菌病毒培養(yǎng)技術(shù)第1頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①對(duì)氧氣要求：專性需氧菌微需氧菌兼性厭氧菌

專性厭氧菌②對(duì)CO2要求：5%CO2①水②碳源③氮源④無(wú)機(jī)鹽⑤生長(zhǎng)因子有些細(xì)菌需要（一）細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的條件4、對(duì)氣體要求

4、PH1、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2、溫度3、滲透壓第2頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第3頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的方式二分裂法繁殖方式：鏈球菌八疊球菌葡萄球菌第4頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的速度第5頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（四）細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的速度

分為四期：遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期第6頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（五）常用培養(yǎng)基種類厭氧培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基第7頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

1細(xì)菌的培養(yǎng)基本知識(shí)2細(xì)菌的規(guī)?；囵B(yǎng)3細(xì)菌的計(jì)數(shù)技術(shù)第8頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、細(xì)菌的規(guī)?；囵B(yǎng)種子接種

是指菌體增殖培養(yǎng)物。收獲時(shí)間

最佳培養(yǎng)時(shí)間依據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線而定。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第9頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法

用于制備抗原、滅活苗、凍干苗。2．液體靜置培養(yǎng)法

需氧菌（深度1/2）和兼性厭氧均可用，厭氧菌（深度3/4），還需加肝塊。3．深層通氣培養(yǎng)法

是目前菌苗生產(chǎn)的主要培養(yǎng)法。安裝有自動(dòng)控溫、消泡、調(diào)pH、自動(dòng)控制通氣量、自動(dòng)磁力攪拌等裝置。細(xì)菌接種1～2h，再通入濾過(guò)除菌空氣，并適當(dāng)攪拌分散通入的氣體，以增加培養(yǎng)液中的溶氧量。及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。第10頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4．透析培養(yǎng)法在細(xì)菌培養(yǎng)液與培養(yǎng)基之間隔有一層透析膜，使培養(yǎng)基中高濃度小分子量的營(yíng)養(yǎng)成分通過(guò)透析膜（不能透過(guò)大分子的細(xì)菌或毒素）不斷擴(kuò)散到細(xì)菌培養(yǎng)液中，供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，獲得高濃度的細(xì)菌或毒素。透析器1.螺栓2.培養(yǎng)基貯存室3.視鏡4.透析膜5.培養(yǎng)室第11頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是一個(gè)恒定體積的流動(dòng)系統(tǒng)，新鮮培養(yǎng)基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液體，細(xì)菌始終保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第12頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

1細(xì)菌的培養(yǎng)基本知識(shí)2細(xì)菌的規(guī)?；囵B(yǎng)3細(xì)菌的計(jì)數(shù)技術(shù)第13頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三細(xì)菌的計(jì)數(shù)技術(shù)細(xì)菌性疫苗在制造中，往往需要計(jì)算每毫升所含細(xì)菌的總數(shù)。

1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法2.活菌計(jì)數(shù)法傾注平板培養(yǎng)法將被測(cè)樣品根據(jù)菌數(shù)含量多少，用普通肉湯或生理鹽水作10倍遞進(jìn)稀釋。分別取其1ml加在滅菌的平皿中，然后取預(yù)先加熱融化且冷至45～50℃，立即搖勻放平，凝固后培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)平皿上長(zhǎng)出的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為每毫升樣品中含有的活菌數(shù)。第14頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月平板表面散布法

接種量為0.1ml

瓊脂板的制備稀釋菌液接種培養(yǎng)計(jì)數(shù)選擇菌落數(shù)在30～300之間的平皿用以計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度應(yīng)取其菌落平均數(shù)。

活菌數(shù)／ml=2個(gè)平板平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。舉例：在10稀釋的平板中所得平均菌落數(shù)為78個(gè)。計(jì)算結(jié)果：78×10×10

=7.8×10個(gè)活菌／ml微量點(diǎn)板計(jì)數(shù)法

接種量為0.02ml10-8-8第15頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3比濁計(jì)數(shù)法

是對(duì)比細(xì)菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)管的濁度，求出大致的菌數(shù)。原理：菌液中含數(shù)多少與其渾濁度成正比。方法：比濁管比濁法和分光光度計(jì)法。優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)便應(yīng)用：常用于菌苗及其他生物制劑的生產(chǎn)、細(xì)菌毒力的測(cè)定和攻毒量的確定等。第16頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月標(biāo)準(zhǔn)比濁法比濁管由國(guó)家生物制品檢定部門提供，每套包括一支細(xì)菌比濁標(biāo)準(zhǔn)管、數(shù)支對(duì)照空管和一張比濁用的圖片。比濁方法將空管拭刷干凈，加入待測(cè)菌液1ml。將標(biāo)準(zhǔn)管與待測(cè)管并列緊貼在圖片前，使兩管受光均勻，然后透過(guò)兩管管壁對(duì)比觀察，目測(cè)圖片的清晰度，并將兩管左右換位，反復(fù)對(duì)比。例如：測(cè)定大腸桿菌的菌數(shù)，若1ml菌液加入4ml的生理鹽水后，與標(biāo)準(zhǔn)管的濁度相同，即表示該菌液經(jīng)5倍稀釋后相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)管的菌數(shù)相當(dāng)于8億個(gè)／ml，故被測(cè)菌數(shù)為8×5=40億個(gè)／ml。第17頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分光光度計(jì)法借助于分光光度計(jì)。在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌液的光密度值注意：測(cè)量時(shí)一定要控制菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。第18頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第19頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

病毒復(fù)制：以病毒基因?yàn)槟０?，在酶的作用下，分別合成基因和蛋白質(zhì)，再組裝成完整的蛋白顆粒，這種方式稱為復(fù)制（replication)。第20頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成第21頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第22頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1

病毒的動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物的選擇應(yīng)當(dāng)選擇SPF動(dòng)物。選擇動(dòng)物的條件下：①選用對(duì)病毒易感性高。②動(dòng)物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性、準(zhǔn)確性和可比性。④外購(gòu)動(dòng)物要了解當(dāng)?shù)貏?dòng)物群健康，飼養(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過(guò)健康觀察，以免誤用帶有病原體動(dòng)物。第23頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動(dòng)物接種途徑和方法第24頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

動(dòng)物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動(dòng)物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動(dòng)情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測(cè)體溫1次，做好記錄。

2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動(dòng)物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。第25頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第26頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2

病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)工序過(guò)程：如何完成此項(xiàng)任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒第27頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月操作要點(diǎn)1禽胚的選擇理想的禽胚是SPF雞胚，常以非免疫雞胚補(bǔ)充。2禽胚的接種前孵育孵化前消毒，溫度37.5～38.5℃，相對(duì)濕度50%～60%，定時(shí)翻蛋，保證通風(fēng)。孵化4～5d照蛋檢查，淘汰無(wú)精蛋和死胚，孵化至所培養(yǎng)病毒需要的日齡即可接種。

第28頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3

禽胚的接種途徑痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡第29頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過(guò)禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。操作要點(diǎn)病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑第30頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5病毒的收獲

操作要點(diǎn)

絨毛尿囊膜接種

尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種第31頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月照蛋任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第32頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月尿囊腔接種法第33頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種部位消毒任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第34頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月尿囊腔接種任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第35頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第36頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實(shí)例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第37頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第38頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動(dòng)物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第39頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使活體動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至2～4個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長(zhǎng)、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。第40頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3病毒的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細(xì)胞以一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

第41頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)常用的細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細(xì)胞直接利用新鮮動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個(gè)細(xì)胞，如雞胚成纖維細(xì)胞，此細(xì)胞對(duì)病毒的檢測(cè)最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細(xì)胞（細(xì)胞株）由原代細(xì)胞或次代細(xì)胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞，如豬腎細(xì)胞株（PK-15）和乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細(xì)胞（非二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞）指不再保持原來(lái)細(xì)胞的二倍體細(xì)胞數(shù)，在體外可以無(wú)限傳代的細(xì)胞，如人子宮癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）和鼠腎腺癌細(xì)胞（RAG細(xì)胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

第42頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.培養(yǎng)液：生長(zhǎng)液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營(yíng)養(yǎng)液

。2.細(xì)胞接種量:適宜。3.pH：一般為7.0～7.4因細(xì)胞種類不同而略有差異。4.溫度：一般為37～38℃。5.氣體：氧氣和二氧化碳。6.無(wú)菌條件：培養(yǎng)的全過(guò)程都要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件第43頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月各種組織是靠細(xì)胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細(xì)胞，必須破壞細(xì)胞間質(zhì)。分散細(xì)胞的方法的三種：機(jī)械分散法：適用于細(xì)胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

酶消化法：此法適用于原代細(xì)胞的制備及細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。螯合劑分散法：一般只用于單層細(xì)胞的分散。

分散細(xì)胞的方法第44頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

1.單層細(xì)胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細(xì)胞分散成2～6個(gè)成團(tuán)的細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長(zhǎng)培養(yǎng)。

2.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過(guò)振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法。3.微載體培養(yǎng)通過(guò)攪拌懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)，使微小細(xì)胞在載體表面繁殖成單層的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，兼有單層和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法第45頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月犢牛肝臟單層細(xì)胞第46頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞的選擇選擇相應(yīng)易感動(dòng)物的組織細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)病毒條件⒈血清：促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁的成分。

⒉溫度：多數(shù)為37℃

。⒊pH值：pH在7.6～7.8

⒋接毒量與接毒方法：一般按維持液的1～10%接入。

第47頁(yè)，課件共49頁(yè)，創(chuàng)作于2