第四章基因克隆的質(zhì)粒載體

第四章基因克隆的質(zhì)粒載體第1頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體單鏈?zhǔn)删w載體噬菌粒載體染色體定位整合載體人工染色體載體其它特殊用途載體第2頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因工程四大要素：目的基因克隆載體工具酶受體系統(tǒng)第3頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月單獨(dú)的基因不易進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)入后不能維持.三、什么是克隆載體？vector通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為DNA克隆載體或基因克隆載體。二、為什么要用克隆載體？第4頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月載體具有如下功能:1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力

3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件第5頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月四、作為克隆載體的DNA分子必須具備主要條件：1.有1至多個(gè)克隆位點(diǎn)，供外源DNA片段組入克隆載體DNA分子。2.能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3.必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因。4.必須是安全的。第6頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月五、克隆載體的種類根據(jù)來源可分為：質(zhì)粒載體病毒或噬菌體載體質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的克隆載體質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的克隆載體等第7頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第9頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第11頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)用途可分為：表達(dá)克隆載體啟動(dòng)子探針型載體

cDNA克隆載體等根據(jù)應(yīng)用對(duì)象可分為：原核生物克隆載體、植物克隆載體和動(dòng)物克隆載體等。第12頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)其復(fù)制或存在方式可分為:自主復(fù)制型載體和附加載體第13頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第四章基因克隆的質(zhì)粒載體第14頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成份.Plasmid一詞由JoshuaLederberg于1952年提出。質(zhì)粒的命名:例:pBR322一、與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)p代表質(zhì)粒;“BR”代表兩位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是實(shí)驗(yàn)編號(hào).第15頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月已在形形色色的細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)質(zhì)粒的宿主范圍較窄，只能生存于親緣關(guān)系很近的少數(shù)細(xì)菌種類中。是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。已進(jìn)化出多種機(jī)制以維持其在細(xì)菌宿主中的穩(wěn)定的拷貝并將質(zhì)粒分子精確地分配給子代細(xì)胞。1.質(zhì)粒的特點(diǎn)：第16頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)。常常含有一些編碼對(duì)細(xì)菌宿主有利的基因。這些基因可賦予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的醫(yī)學(xué)和商業(yè)價(jià)值。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制酶與修飾酶，以及降解復(fù)雜的有機(jī)化合物等。第17頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒通過合成長(zhǎng)效致死物和短效解毒劑得以在細(xì)菌中生存.第18頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒絕大多數(shù)是環(huán)形雙鏈的DNA但也存在有線形質(zhì)粒、RNA質(zhì)粒（酵母的殺傷質(zhì)粒）2.質(zhì)粒的生物學(xué)特征只能在在寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立增殖，隨寄主分裂而遺傳。自然界中，無論是真核生物還是原核生物細(xì)胞，甚至真菌的線粒體中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。質(zhì)粒DNA分子可以穩(wěn)定存在于染色體外，呈游離狀態(tài),有一些質(zhì)粒在一定條件下能可逆地整合到寄主染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制,稱為附加體。第19頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月3.環(huán)形雙鏈DNA質(zhì)粒分子組成與構(gòu)型多數(shù)為雙鏈環(huán)狀DNA分子.分子量從不足2kb到100kb以上,多數(shù)為10kb左右.具有三種不同的構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA):兩條多核苷酸鏈均保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)。DNA呈超螺旋的SC構(gòu)型。開環(huán)DNA(ocDNA)：有一條保持完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口。即OC構(gòu)型。線性分子（lDNA)：經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割之后，雙鏈斷裂而形成。稱L構(gòu)型。第21頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月什么是超螺旋(superhelix或supercoil)？

DNA是以雙螺旋的形式圍繞著同一軸纏繞的，當(dāng)雙螺旋DNA的這個(gè)軸再彎曲纏繞時(shí)，DNA就處于超螺旋狀態(tài)，

DNA超螺旋狀態(tài)是結(jié)構(gòu)張力的表現(xiàn)。超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要特征。

正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反第22頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月4.作為克隆載體質(zhì)粒的條件適于作為基因克隆載體的所有質(zhì)粒DNA分子，都必須包括三種共同的組分：復(fù)制子選擇性標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)基因克隆載體還需要滿足具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)第24頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)分子特性，革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)?？煞譃閮煞N接合型又叫自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒具有自主復(fù)制所必須的遺傳信息之外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。

可以在不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。非接合型的質(zhì)粒不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，失去控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。不能自主轉(zhuǎn)移。5、質(zhì)粒的類型第25頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月F質(zhì)粒的tra區(qū)包含細(xì)菌接合所需的基因第26頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與遷移.轉(zhuǎn)移一般指一個(gè)質(zhì)粒獨(dú)立地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞.遷移則指本身不能轉(zhuǎn)移,在另一個(gè)接合型質(zhì)粒存在下,從一個(gè)細(xì)胞移至另一種細(xì)胞.質(zhì)粒遷移的條件（自身編碼）①bom位點(diǎn)(colE1)nic位點(diǎn).②mob基因.結(jié)合動(dòng)員基因.編碼遷移蛋白,實(shí)質(zhì)是一種核酸酶,切割nic位點(diǎn).遷移作用(mobiligation):由共存接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的遷移過程.第28頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月從基因工程安全角度考慮，接合型質(zhì)粒不宜作為克隆載體。因?yàn)閺睦碚撋洗嬖谥l(fā)生使ＤＮＡ跨越生物種間遺傳屏障的潛在危險(xiǎn).而利用遷移作用可能將非接合型質(zhì)粒從一種細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一種細(xì)胞,這種方法叫三親雜交法.一般將受體菌、供體菌及輔助轉(zhuǎn)移菌三者共培養(yǎng)過夜.在基因工程中得到大量的應(yīng)用.第30頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月三親雜交法第31頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)質(zhì)粒的性狀特征，可分為五種不同的類型：F(Fertility)質(zhì)粒:

Ｒ(Resistance)質(zhì)粒Col質(zhì)粒降解質(zhì)粒（Degradativeplasmids）致瘤質(zhì)粒（Virulenceplasmids）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒

第32頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移功能分類按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號(hào)分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)

接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒第33頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)質(zhì)粒的表現(xiàn)分為:定義：質(zhì)粒除了與控制本身復(fù)制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，有的質(zhì)粒還攜帶一些其他的基因，宿主細(xì)胞由于含有這樣的質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，這樣的質(zhì)粒稱為顯性質(zhì)粒。相反，即使宿主細(xì)胞含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表露，這樣的質(zhì)粒稱為隱蔽質(zhì)粒。受檢測(cè)手段的限制，現(xiàn)定為隱蔽型的質(zhì)粒未必是真正的隱蔽質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒第34頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為:

(1)多拷貝質(zhì)粒

(2)測(cè)序質(zhì)粒(3)整合質(zhì)粒

(4)穿梭質(zhì)粒(5)表達(dá)質(zhì)粒(6)探針質(zhì)粒

第35頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的復(fù)制子決定其拷貝數(shù)。復(fù)制子是一個(gè)遺傳單位，包括DNA復(fù)制起點(diǎn),相關(guān)的調(diào)控元件,復(fù)制終點(diǎn)。6、質(zhì)粒的復(fù)制復(fù)制起點(diǎn)是一段特定的DNA片段，長(zhǎng)約幾百堿基對(duì)，其相關(guān)的順式作用調(diào)控元件中含有參與DNA合成起始的由質(zhì)粒或宿主編碼的可擴(kuò)散因子的結(jié)合位點(diǎn)。定義：質(zhì)粒DNA中能自主復(fù)制并維持正常拷貝數(shù)的一段最小的核酸序列單位。第36頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月與一個(gè)起始點(diǎn)相連而沒有被終點(diǎn)隔斷的任何序列,都是作為復(fù)制子的一部分而被復(fù)制.起始點(diǎn)是一種順式作用位點(diǎn),只能作用于該位點(diǎn)所在的DNA分子.第37頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的拷貝數(shù)定義:(1)通常定義:生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(LB培養(yǎng)基)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中平均所含有的質(zhì)粒的拷貝數(shù).(2)特殊定義:在營(yíng)養(yǎng)富有余的培養(yǎng)基中,每個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每條染色體所擁有的平均質(zhì)粒DNA分子數(shù).(3)<基因工程原理>中定義:在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的每個(gè)細(xì)胞,如果具有20個(gè)及以上的質(zhì)粒DNA分子,就叫高拷貝質(zhì)粒,如果低于20個(gè)則叫低拷貝質(zhì)粒.第38頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類：

嚴(yán)緊型（stringentplasmid)每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有１－３份的拷貝。松弛型（relaxedplasmid)每個(gè)寄主細(xì)胞中僅有１０－６０份的拷貝。一般接合型的質(zhì)粒是嚴(yán)緊型，具有較高的分子量。而非接合型的質(zhì)粒是松馳型的，具有較低的分子量。例外，接合型的質(zhì)粒Ｒ6K分子量較小，為松馳型。質(zhì)粒中已鑒定的復(fù)制子已逾30個(gè)，但分子克隆中常用的幾乎都帶有一個(gè)來源于pMB1的復(fù)制子，可使每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中維持１５－２０個(gè)拷貝。第39頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月即同一種質(zhì)粒在不同的寄主類型中可能屬于嚴(yán)緊型的，也可能屬于松馳型的。如ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松弛型的,在奇異變形桿菌中是嚴(yán)緊型的。質(zhì)粒拷貝數(shù)還與寄主狀況有關(guān)。第40頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月氯霉素?cái)U(kuò)增:

pMB1或ColEI類質(zhì)粒復(fù)制子的復(fù)制完全依靠宿主細(xì)胞提供的半衰期較長(zhǎng)的復(fù)制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。

第41頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）的復(fù)制子的復(fù)制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復(fù)制。

第42頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒復(fù)制控制的分子模型抑制蛋白稀釋模型阻遏蛋白在低濃度時(shí)處于單體狀體，高濃度時(shí)處于多體狀態(tài)。只有多體狀態(tài)具有活性自體阻遏蛋白質(zhì)模型阻遏蛋白具有自體阻遏活性。第43頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第45頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月7、質(zhì)粒的不相容性(不親和性)指在沒有選擇壓力下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠共存于同一個(gè)寄主細(xì)胞系中的現(xiàn)象。只有當(dāng)兩種質(zhì)粒在同一寄主細(xì)胞中都不受限制時(shí)，才能判斷。親緣關(guān)系較近的質(zhì)粒，彼此之間互不相容，它們屬于同一種不親和群。大腸桿菌質(zhì)粒中至少已鑒別出３０種以上的不親和群。第46頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象與質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分離的調(diào)控有關(guān)。攜帶相同復(fù)制子的不同質(zhì)粒屬于同一不相容組。帶有不可互換成分的復(fù)制子的質(zhì)粒則屬于不同的不相容組。大多數(shù)質(zhì)粒都會(huì)產(chǎn)生出一種控制質(zhì)粒復(fù)制的阻遏蛋白質(zhì)，其濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)成正比。阻遏蛋白通過同其靶序列間的相互作用，使雙鏈ＤＮＡ中的一條斷裂從而導(dǎo)致質(zhì)粒ＤＮＡ復(fù)制的啟動(dòng)。并建立起一種調(diào)節(jié)質(zhì)粒拷貝數(shù)的負(fù)反饋環(huán)。當(dāng)質(zhì)粒面臨高拷貝數(shù)和高濃度的阻遏蛋白時(shí)，其復(fù)制活動(dòng)便被抑制了。反之，復(fù)制反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。第47頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月8.質(zhì)粒ＤＮＡ的分離與純化(1)氯化銫密度梯度離心法(2)堿變性法(3)微量堿變性法第49頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月氯化銫密度梯度離心法1、質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；2、在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片段，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；3、染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。第50頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月流程：首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會(huì)嵌入到DNA鏈的堿基中去。在EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。

第51頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月堿變性法：

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片段之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在PH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性PH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速復(fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA第54頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月流程：1、取1.5毫升含質(zhì)粒的大腸桿菌過夜培養(yǎng)物，加在微量離心管中，離心收集細(xì)胞沉淀；2、加入100微升冰冷的液，（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH=8.0,10mMEDTA，4~5mg溶菌酶）靜置5分鐘；3、加入200微升微冷的液（0.2NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。65度水浴一段時(shí)間會(huì)加強(qiáng)染色體DNA的變性作用。4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸鈉，振蕩后，冰浴5分鐘。5、離心的上清液用苯酚抽提數(shù)次，用乙醇沉淀收集質(zhì)粒DNA。第55頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素：

1、寄主菌株的遺傳背景使用endA基因發(fā)生突變的菌株，編碼核酸內(nèi)切酶從野生型的菌株中提取質(zhì)粒須采取的措施：

選擇最適的培養(yǎng)條件，以限制在細(xì)胞生長(zhǎng)期間，體內(nèi)核酸內(nèi)切酶的表達(dá)；在純化質(zhì)粒DNA的過程中，用加熱法核酸內(nèi)切酶使失活；采用最佳的實(shí)驗(yàn)流程，減少核酸內(nèi)切酶的污染并在純化了質(zhì)粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。第56頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子的大小

插入分子量大的外源DNA會(huì)引起質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降。第57頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月二、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略

一般條件：選擇適合手頭工作目標(biāo)的質(zhì)粒載體選擇載體上的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)用合適的連接反應(yīng)條件選用最適合擴(kuò)增外源目的ＤＮＡ的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株具備篩選轉(zhuǎn)化子的方法和驗(yàn)證目的基因克隆的技術(shù)有時(shí)需要特殊的步驟以降低轉(zhuǎn)化菌落的背景在每一階段都需要設(shè)置陰性及陽性對(duì)照第58頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略：(１)質(zhì)粒載體應(yīng)該能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制。作為質(zhì)粒的克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。所以含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori)，最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。(２)必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，且這樣的克隆位點(diǎn)盡可能多。為了便于多種類型末端的DNA片段的克隆，質(zhì)?？寺≥d體中往往組裝一個(gè)含多種限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的多克隆位點(diǎn)(MCS)連桿。第59頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月(３)必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。(4)質(zhì)粒載體本身DNA分子應(yīng)盡可能小。(５)根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種‘元件’，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。如在克隆位點(diǎn)上游組裝強(qiáng)的啟動(dòng)子，下游組裝相應(yīng)的終止子，就成為強(qiáng)表達(dá)質(zhì)粒克隆載體?；蛘咴谫|(zhì)粒克隆載體的合適位置組入受體細(xì)胞染色體DNA的同源序列，成為基因整合平臺(tái)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒克隆載體。第60頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒克隆載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過程應(yīng)遵循的原則：(１)選用合適的出發(fā)質(zhì)粒。(２)正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。(３)組裝合適的選擇標(biāo)記基因。(４)選用合適的啟動(dòng)子。(５)在能達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過程應(yīng)力求簡(jiǎn)單。第61頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型

1.

天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有EolE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。

第62頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個(gè)EcoR酶切位點(diǎn)，一個(gè)四環(huán)素抗性選擇記號(hào)（Tetr），插入外源片段后不影響其復(fù)制功能，但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。第63頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點(diǎn)EcoRl中克隆外源DNA片段后，可根據(jù)對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對(duì)大腸桿菌素E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。第64頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月2.理想的質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1)具有復(fù)制起點(diǎn)自我增殖的基本條件，一般具一個(gè)復(fù)制子。(2)具有抗菌素抗性理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。(3)具有若干限制酶切單一位點(diǎn)（MCS）(4)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片段后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞，同時(shí)低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)，可獲得大量的克隆基因。第65頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點(diǎn)在這兩個(gè)選擇性標(biāo)記的單酶切位點(diǎn)上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）第66頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月3.質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)新陳代謝特性；對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；

四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、鏈霉素抗性、卡那霉素抗性大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；抗菌素抗性記號(hào)便于操作、易于選擇。第67頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月二、質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記抗菌素名稱作用方式抗性機(jī)理氨芐青霉素干擾細(xì)菌胞壁的合成產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)。氯霉素作用50S亞基，干擾蛋白合成。產(chǎn)生乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；Щ?。卡那霉素作用70S亞基，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)讀。產(chǎn)生的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，修飾卡那霉素。鏈霉素作用30S亞基，導(dǎo)致mRNA錯(cuò)譯。產(chǎn)生的特殊酶，修飾鏈霉素。四環(huán)素作用30S亞基，干擾蛋白合成。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)菌的膜修飾，阻止四環(huán)素進(jìn)入菌內(nèi)。第68頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月4.不同類型的質(zhì)粒載體（1）高拷貝的質(zhì)粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因（2）低拷貝的質(zhì)粒載體有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。第69頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

(3)失控的質(zhì)粒載體

復(fù)制控制是溫度敏感型的低拷貝的質(zhì)粒。Example：pBEU1和pBEU2質(zhì)粒，在30度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2~3小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNA占細(xì)胞總DNA的50%。第70頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

(4)插入失活型質(zhì)粒載體將外源DNA片段插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機(jī)會(huì)。Example：在pBR329質(zhì)粒載體的EcoR1位點(diǎn)插入外源片段，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片段的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯著上升。

第71頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月(5)正選擇的質(zhì)粒載體正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。第72頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月Example：

質(zhì)粒pKN80有來自Mu噬菌體DNA的EcoR1-C的片段，編碼一種致死功能的kil基因。該質(zhì)粒在Mu噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind或Hpa位點(diǎn)插入外源DNA片段后，會(huì)產(chǎn)生具Ampr表型的Mu噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株。第73頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制：1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基2、可使用的克隆位點(diǎn)少3、假陽性水平高4、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性第74頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月(6)表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體：按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。

第75頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。第76頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

第77頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月四、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體

1、pSC101質(zhì)粒載體；

2、ColE質(zhì)粒載體；

3、pBR322質(zhì)粒載體；

4、pUC質(zhì)粒載體；

5.其它的重要的質(zhì)粒載體第78頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月1.pSC101質(zhì)粒載體一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的地拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有Hind、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、Sma7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在Hind、BamH、Sma3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會(huì)導(dǎo)致tetr基因失活。是第一個(gè)真核生物的克隆載體。第79頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第80頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體

—葡萄球菌質(zhì)?；蛟诖竽c桿菌中的表達(dá)

金黃色葡萄球菌的質(zhì)粒p1258,編碼若干種能在大腸桿菌檢測(cè)的結(jié)構(gòu)基因；能被核酸限制酶

EcoR切割成4段。第81頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第82頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作基因克隆載體—在大腸桿菌中克隆非洲爪蟾DNA用核酸內(nèi)切酶EcoR消化非洲爪蟾的核糖體DNA（rDNA），與EcoR消化的pSC101質(zhì)粒進(jìn)行重組。在挑取的55個(gè)轉(zhuǎn)化子中，經(jīng)EcoR酶切，電泳后13個(gè)轉(zhuǎn)化子含有外源片段。轉(zhuǎn)化率23.6％第83頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月2.ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因。第85頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第86頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

用ColE1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性：1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便；2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。第87頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月3.pBR322質(zhì)粒載體第88頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322的構(gòu)建：為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對(duì)小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）。

第89頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月第90頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322的結(jié)構(gòu)來源第91頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：1、具有較小的分子量

它的分子量為4363bp。克隆載體的分子量大小不要超過10kb。

2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片段可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)。第92頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月Example:a.在pBR322質(zhì)粒的BamH或Sal位點(diǎn)插入外源DNA片段，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們涂布于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片段的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第93頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月BXBBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX第94頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

b.在Pst或Sca識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致Ampr基因的失活，產(chǎn)生AmpsTetr表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測(cè)出來。其依據(jù)是Ampr表型的細(xì)胞可以合成β–內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素β–內(nèi)酰胺酶Ampr的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps菌落無此反應(yīng)。第95頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝。第96頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

pBR322質(zhì)粒載體的改良為了更加實(shí)用，人們對(duì)pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點(diǎn)。第97頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用pBR322質(zhì)粒作為基因克隆載體—水稻葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA的結(jié)構(gòu)分析

基因psbA編碼的蛋白質(zhì)，與光合作用系統(tǒng)相關(guān)，并且它能與除草劑阿特拉津結(jié)合，它的第264位氨基酸發(fā)生取代反應(yīng)，由絲氨酸變?yōu)楦拾彼幔蓪?dǎo)致其失去與除草劑阿特拉津結(jié)合的能力，推測(cè)是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變；在原生生物衣藻、藍(lán)色細(xì)菌中，此蛋白質(zhì)在同一位置由絲氨酸變?yōu)楸彼岬娜〈磻?yīng)，會(huì)使他們獲得對(duì)除草劑的抗性功能。而且，非競(jìng)爭(zhēng)條件下，對(duì)除草劑阿特拉津抗性的千里光屬和莧屬，干物質(zhì)產(chǎn)量比敏感植物下降了25%和40%。

第98頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

通過對(duì)基因psbA的體外操作，有可能創(chuàng)造出抗除草劑的或高光效的轉(zhuǎn)基因植株。用pBR322質(zhì)粒作為載體，成功的克隆了水稻的psbA基因。

首先，將水稻葉綠體DNA，用EcoR內(nèi)切酶消化，經(jīng)含有溴化乙錠的熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收分子大小為1.8～2.5kb之間的DNA片段。

再與經(jīng)過EcoR內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒DNA連接。

然后轉(zhuǎn)化給大腸桿菌，在氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。用經(jīng)32p標(biāo)記的玉米psdADNA探針作菌落雜交，從1000多個(gè)菌落中篩選出8個(gè)陽性克隆。第99頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月

對(duì)這8個(gè)陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的Southern分析，表明6個(gè)片段帶有長(zhǎng)度為2.2kb的編碼水稻葉綠體psdA基因。實(shí)際上其中1.2kb的片段編碼著水稻psdA基因的全部序列。通過dna序列分析表明與高等植物的同原性在92%，與藍(lán)色細(xì)菌同源性75%。第100頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月4.

pUC質(zhì)粒載體人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。

第101頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。

3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。第102頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月AmproripUC18(3kb)MCS(Multiplecloningsites,

多科隆位點(diǎn)）LacpromoterlacZ’第103頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC質(zhì)粒載體的形體圖第104頁，課件共119頁，創(chuàng)作于2023年2月pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù)僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶?/p>