細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)-課件

+細(xì)胞培養(yǎng)

技術(shù)1PPT課件+細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

－在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛第一節(jié) 基本知識(shí)第二節(jié) 細(xì)胞生存環(huán)境、條件和代謝第三節(jié) 基本技術(shù)（見(jiàn)視頻）2PPT課件+第一節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念二、培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)三、培養(yǎng)細(xì)胞的增殖過(guò)程3PPT課件+細(xì)胞培養(yǎng)cellculture

（組織培養(yǎng)tissueculture）概念從生物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存和生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。始于20世紀(jì)初（1907年Harrison，1912年Carrel）

凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法4PPT課件+細(xì)胞培養(yǎng)的目的與用途科學(xué)研究：藥物研究開(kāi)發(fā)與基礎(chǔ)研究1、新藥篩選；2、疫苗研究與開(kāi)發(fā)；3、基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā)；4、細(xì)胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā)；5、單克隆抗體制備；6、藥物作用機(jī)理；7、基因功能研究；8、疾病發(fā)生機(jī)制研究5PPT課件+對(duì)細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的評(píng)價(jià)＊＊優(yōu)點(diǎn)1、直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。2、便于用各種不同技術(shù)方法研究細(xì)胞。3、培養(yǎng)細(xì)胞攜帶有體內(nèi)細(xì)胞同等的基因組。4、同時(shí)提供大量的生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。＊＊缺點(diǎn)

組織和細(xì)胞離體后獨(dú)立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中，雖然模擬體內(nèi)環(huán)境，仍有很大差異。因而利用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí)，不應(yīng)視為體內(nèi)細(xì)胞完全相同，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。6PPT課件+體內(nèi)、外細(xì)胞的差異體內(nèi)細(xì)胞：

機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)

和其他類型細(xì)胞影響

基因表達(dá)受到外來(lái)信號(hào)調(diào)節(jié)

增殖過(guò)程中不斷發(fā)生著分化（由一般到特殊）體外細(xì)胞：失去機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和其他類型細(xì)胞影響細(xì)胞的許多外來(lái)信號(hào)被切斷特定分化基因表達(dá)減弱或停止而進(jìn)化中保守的增殖活動(dòng)維持（由特殊到一般）與體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的差異特征：失去原有形態(tài)，分化特性減弱 形態(tài)和功能趨于單一 一定代數(shù)后衰老死亡， 或發(fā)生轉(zhuǎn)化， 獲不死性而成為能無(wú)限傳代

高度特化的結(jié)構(gòu)和功能7PPT課件+培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)分類根據(jù)是否附于支持物上生長(zhǎng)的特性，分為貼附型和懸浮型。1、貼附型

細(xì)胞貼附在支持物表面生長(zhǎng)，只依賴貼附才能生長(zhǎng)的細(xì)胞叫做貼附型細(xì)胞（Anchorrage-dependentcells）。大多數(shù)細(xì)胞屬此型。失去在體內(nèi)特有形態(tài)。成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、游走型、多形型8PPT課件+

成纖維細(xì)胞人腎小管上皮細(xì)胞多形型黃色瘤細(xì)胞游走型巨噬細(xì)胞9PPT課件+2、懸浮型細(xì)胞（suspendedcelltype）

懸浮生長(zhǎng)，單個(gè)分散或成團(tuán)。各種源自血液的細(xì)胞、骨髓、脾細(xì)胞。10PPT課件+培養(yǎng)細(xì)胞的增殖過(guò)程細(xì)胞增殖

細(xì)胞分裂形成子代細(xì)胞的過(guò)程。增殖周期：

間期（G1-S-G2

期）和有絲分裂期（M期）

群體中多數(shù)細(xì)胞處于間期，少數(shù)處于分裂期

間期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，分裂期較短。11PPT課件+培養(yǎng)細(xì)胞的生命期定義:

細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期.原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出細(xì)胞接種后到第一次傳代。一般維持1－4周。細(xì)胞系：原代細(xì)胞一經(jīng)傳代就成為細(xì)胞系（Cellline），進(jìn)入傳代期。此期在全生命期中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，一般傳10－50代。隨后細(xì)胞增殖緩慢以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期。(Hayflick極限的概念)衰退期：細(xì)胞增殖緩慢以至完全停止，細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞：無(wú)限細(xì)胞系，永久增殖。12PPT課件+Hayflick極限

體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無(wú)限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個(gè)體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。13PPT課件+培養(yǎng)細(xì)胞一代的增殖過(guò)程傳代：

培養(yǎng)容器中細(xì)胞增殖至一定密度后，分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液的過(guò)程

一代:

細(xì)胞接種后到下一次傳代的一段時(shí)間

細(xì)胞一代的三個(gè)階段：

潛伏期、指數(shù)增生期、平臺(tái)期實(shí)驗(yàn)研究多在指數(shù)增長(zhǎng)期進(jìn)行14PPT課件+第二節(jié)細(xì)胞生存環(huán)境、條件和代謝

---培養(yǎng)的細(xì)胞生存途徑和物質(zhì)代謝與體內(nèi)細(xì)胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現(xiàn)一定差異。15PPT課件+（一）環(huán)境

培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。保證細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)任何污染、代謝物及時(shí)清除，是維持細(xì)胞生存的基本條件。

16PPT課件+(二)溫度：人哺乳動(dòng)物：36.5℃±0.5℃;鳥(niǎo)類：38.5℃;

一般培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比高溫強(qiáng)，溫度上升不超過(guò)39℃時(shí),細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比。39～40℃

1小時(shí),受損傷的細(xì)胞可能恢復(fù)；41～42℃

1小時(shí),嚴(yán)重?fù)p傷,個(gè)別細(xì)胞恢復(fù)；43℃以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。17PPT課件+溫度不低于0℃時(shí),細(xì)胞代謝有影響,無(wú)傷害作用;置于25～35℃，細(xì)胞能生存，但生長(zhǎng)速度減慢；放在4℃數(shù)小時(shí),再放回37℃細(xì)胞仍繼續(xù)生長(zhǎng)。細(xì)胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí),細(xì)胞因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。18PPT課件+

(三)氣體環(huán)境氣體：氧氣和二氧化碳氧氣:參與三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和合成各種所需成分。氧氣分壓1995～89975Pa,適用于封閉式單層細(xì)胞培養(yǎng);開(kāi)放式培養(yǎng)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng))細(xì)胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環(huán)境中。19PPT課件+（四）細(xì)胞生存所需基本物質(zhì)

與體內(nèi)基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂類三大類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，一定量的無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及代謝方式與體內(nèi)細(xì)胞不盡相同。20PPT課件+

細(xì)胞耐酸比耐堿性大一些,在堿性的環(huán)境中時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可使細(xì)胞堿中毒，而在偏酸性環(huán)境中更有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，最常用磷酸鹽緩沖劑方法，如PBS、Hanks平衡液等。21PPT課件+1、糖是合成某些氨基酸的原料；經(jīng)過(guò)乙酰輔酶A（CoA）合成脂肪；經(jīng)過(guò)糖解磷酸通路能合成核酸。各種糖的吸收取決于它們進(jìn)入細(xì)胞的能力,其中葡萄糖最強(qiáng),半乳糖最低。22PPT課件+2.氨基酸：

12種氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、異亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的原料。23PPT課件+需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為固定組成。脂溶性維生素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有作用,一般從血清中得到補(bǔ)充。24PPT課件+3.促生長(zhǎng)因子：培養(yǎng)液除營(yíng)養(yǎng)成分外，也需要激素類物質(zhì)起到促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)作用。胰島素(1-10單位)促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松(10-8-10-7M)促進(jìn)表皮上皮細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用，提高神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的克隆形成率；雌激素和雄激素，或使用黃體酮和氫化可的松對(duì)乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)效果則更好。血清是提供生長(zhǎng)因子和其細(xì)胞所需物質(zhì)的來(lái)源。目前血清、各種組織和其它生物成分，用生物工程的方法提取并商品化。25PPT課件+4.

其它物質(zhì)：在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中,需要鉀、鈉、鈣、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒銅、錳等。需要促細(xì)胞粘附物質(zhì)其，作用是：有助于促細(xì)胞貼附在各種底物或支持物上生長(zhǎng)。26PPT課件+5.人工培養(yǎng)基：細(xì)胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除注意到無(wú)菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養(yǎng)基，是供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和保證細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。培養(yǎng)基的種類分為半固體和液體培養(yǎng)基兩類。液體培養(yǎng)基：分為合成、天然和無(wú)血清培養(yǎng)基三種。27PPT課件+A．合成培養(yǎng)基：成分清楚,通過(guò)調(diào)節(jié)各種成分的數(shù)量和種類,再借觀察細(xì)胞生物狀況反應(yīng)性變化,測(cè)定細(xì)胞與外界環(huán)境的適應(yīng)能力。借以了解細(xì)胞生存條件,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行定向分化的等。

合成培養(yǎng)基在應(yīng)用上廣泛。28PPT課件+B．天然培養(yǎng)基：

用人或動(dòng)物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清。血清含有多種促生長(zhǎng)因子、貼附因子及其它活性物質(zhì)等。加入5％血清：維持細(xì)胞不死或緩慢生長(zhǎng)；加入10％～20％血清：細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。29PPT課件+血清的主要作用提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增殖所必需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。補(bǔ)充培養(yǎng)液中沒(méi)有或量不足的營(yíng)養(yǎng)成分。含有生長(zhǎng)基質(zhì)成分使細(xì)胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。提供載體蛋白，可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害。提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞不受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。30PPT課件+血清存在的問(wèn)題存在有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì)。如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長(zhǎng)抑制因子。成分不明確，影響對(duì)結(jié)果的分析。不同動(dòng)物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結(jié)果不穩(wěn)定。31PPT課件+C.無(wú)血清培養(yǎng)基：培養(yǎng)基內(nèi)加入促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)各種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子已達(dá)幾十種。還有三碘甲狀腺素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及大鼠頜下腺粗提物。具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用。32PPT課件+第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)一、細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)二、培養(yǎng)細(xì)胞的傳代三、細(xì)胞計(jì)數(shù)四、觀察五、細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸六、污染的檢測(cè)和對(duì)策33PPT課件一、細(xì)胞分離細(xì)胞懸液：離心收集組織塊

1.機(jī)械分散

2.剪切分離

3.消化分離 胰蛋白酶法 膠原酶法34PPT課件+細(xì)胞分離步驟除去組織間質(zhì)用無(wú)Ca2+Mg2+

的PBS清洗組織胰酶/EDTA溶液消化組織清洗細(xì)胞并做細(xì)胞計(jì)數(shù)完全培養(yǎng)基抑制胰酶作用加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)35PPT課件二、培養(yǎng)細(xì)胞的傳代(subculture)原代培養(yǎng)的首次傳代（數(shù)量、純度）細(xì)胞傳代方法 貼壁細(xì)胞的傳代 懸浮細(xì)胞的傳代細(xì)胞系的維持36PPT課件+細(xì)胞消化步驟搖動(dòng)培養(yǎng)瓶終止消化倒掉細(xì)胞上清液加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)離心并分離細(xì)胞洗滌細(xì)胞

37PPT課件細(xì)胞系的維持

⑴細(xì)胞系檔案要記錄好。⑵維持傳代的規(guī)律性。⑶多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，以防細(xì)胞之間的交叉污染。傳代時(shí)所用器械要編號(hào)或做好標(biāo)記，嚴(yán)禁交叉使用。⑷每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，防止由于培養(yǎng)細(xì)胞污染等因素造成細(xì)胞系的絕種；另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用最好凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或發(fā)生改變。38PPT課件培養(yǎng)細(xì)胞觀察培養(yǎng)液細(xì)胞生長(zhǎng)概況細(xì)胞形態(tài)變化微生物污染細(xì)胞活力檢測(cè)（0.4%taipanlan染）39PPT課件細(xì)胞凍存的原理

在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成結(jié)晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水等，能引起細(xì)胞死亡。向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。貯存在－130℃以下低溫中能減少冰晶的形成。溶解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞最易受損的－5℃～0℃后，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力不受損害。

40PPT課件+細(xì)胞凍存步驟胰酶消化法收集細(xì)胞洗滌細(xì)胞用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞液氮保存細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至106~107/ml逐漸降低細(xì)胞溫度收集細(xì)胞細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞層細(xì)胞41PPT課件細(xì)胞