血清蛋白電泳醋纖電泳圓盤電泳

血清蛋白電泳醋纖電泳圓盤電泳第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品分子進(jìn)行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。

一、電泳技術(shù)第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳速度:帶電粒子在電場中運(yùn)動時，單位電場強(qiáng)度內(nèi)粒子運(yùn)動的速度，以u表示，即

V—粒子運(yùn)動的速度X—電場強(qiáng)度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月影響電泳速度的因素1、影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度溶液的pH值溶液的離子強(qiáng)度電滲現(xiàn)象2.影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：樣品所帶凈電荷的量樣品的大小和形狀第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。三、實(shí)驗(yàn)原理第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。γβα2α1清蛋白第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)相對分子質(zhì)量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.實(shí)驗(yàn)材料：未溶血的人血清2.實(shí)驗(yàn)試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.實(shí)驗(yàn)器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀鑷子點(diǎn)樣器玻棒粗濾紙培養(yǎng)皿吸量管直尺及鉛筆四、試劑及器材第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.準(zhǔn)備醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理：將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時分辨出光滑面和粗糙面。標(biāo)記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端1.5cm處劃線即為點(diǎn)樣線并作好標(biāo)記。五、試驗(yàn)方法第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳槽的準(zhǔn)備

電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負(fù)極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，濾紙或紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了濾紙橋。根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁減尺寸合適的率紙條，放入電泳槽，待濾紙條濕潤后，用玻璃棒擠壓排氣，使濾紙緊貼膜支架。第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2.點(diǎn)樣（關(guān)鍵）

取出浸透的薄膜，平放在濾紙上(無光澤面向上)，用濾紙輕輕吸去多余的緩沖液，薄膜的粗糙面向上平放在點(diǎn)樣模板上，底邊對齊，點(diǎn)樣區(qū)距負(fù)極1.5cm。點(diǎn)樣時，用磨光的玻片蘸取血清后，均勻的涂抹在點(diǎn)樣區(qū)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。（見圖）注意：點(diǎn)樣時動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。另外操作過程要防止指紋污染。第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月3.電泳將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂，使膜平衡10min。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.3mA/cm膜寬度。通電10min-15min后，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度0.5mA/cm膜寬度，電泳時間50min。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。點(diǎn)樣端1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板

第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月4.染色電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5.漂洗

用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每10min左右換一次液，連續(xù)更換數(shù)次，直至背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月6.記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進(jìn)行描述、記錄在實(shí)驗(yàn)本上，并判斷分析其結(jié)果。

清蛋白

12第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、洗脫法：剪下各蛋白區(qū)帶0.02mol/LNaOH洗脫將洗脫液用分光光度計比色結(jié)果計算每種蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)量的相對含量=該種蛋白管光密度讀數(shù)各管光密度讀數(shù)之和×100%六、各蛋白組分的定量第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月2、光密度計掃描法

清蛋白

12清蛋白

12第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細(xì)胞合成

正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％血漿蛋白的主要功能:維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值,維持酸堿平衡運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì),代謝物,激素,藥物及金屬離子等免疫作用七、臨床意義第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2和β球蛋白升高；慢性活動性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高；急性炎癥：α1、α2球蛋白升高；慢性炎癥：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高；紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：白蛋白降低，γ球蛋白顯著升高；多發(fā)性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β和γ球蛋白區(qū)帶之間出現(xiàn)“M”帶。第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。2、點(diǎn)樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。3、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。4、電泳時應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。5、通電過程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。6、應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進(jìn)行復(fù)染。第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)三血清蛋白質(zhì)聚丙酰胺凝膠圓盤電泳第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月1.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

2.掌握聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個組分。因此具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。適用于不同相對分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。根據(jù)有無濃縮效應(yīng)可分為：連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)，其中不連續(xù)系統(tǒng)因具有濃縮效應(yīng)，分離條帶清晰度及分辨率較佳應(yīng)用更為廣泛，本次試驗(yàn)應(yīng)用的為不連續(xù)系統(tǒng)。第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月

以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì)的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)。為了提高聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率,通常采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，即在分離膠上面有一層濃縮膠，因濃縮膠和分離膠中的離子成分、pH、凝膠濃度不同，電泳開始后，由于濃縮效應(yīng),較厚的蛋白質(zhì)加樣層可以被濃縮成很薄的蛋白質(zhì)層，使電泳具有良好的分辨率。第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月濃縮效應(yīng)：濃縮膠的濃度小于分離膠的濃度，因凝膠孔徑的不連續(xù)使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)域，從而提高分離效果。緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性也能造成濃縮效應(yīng)：電極緩沖液通常為pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液，樣品及凝膠（濃縮膠）中緩沖液為pH6.7Tris-HCL緩沖液。電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮。1cm厚樣品層可以壓縮0.25μm的厚度。分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電荷越多遷移越快三大效應(yīng)第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月成分pH值孔徑電泳緩沖液甘氨酸(慢離子)8.3樣品蛋白質(zhì)6.7濃縮膠Cl-(快離子)6.7大分離膠Cl-(快離子)8.9小有效遷移率=遷移率解離度氯離子>蛋白質(zhì)陰離子>甘氨酸陰離子不連續(xù)系統(tǒng)第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1.實(shí)驗(yàn)材料：正常人血清2.實(shí)驗(yàn)器材：圓盤電泳槽、電泳儀、玻璃管（10cm×0.6cm）、洗耳球、培養(yǎng)皿、微量加樣器、注射器、小燒杯、脫色搖床第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月試劑號配方PH1單體交聯(lián)劑丙烯酰胺（Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸餾水到100ml2過硫酸銨1g+10ml蒸餾水3四甲基乙二胺（TEMED）4電泳緩沖液硼砂30.512g硼酸4.948g蒸餾水定容至1000ml工作液：90ml貯儲液+1440ml水9.05固定液三氯乙酸12.5g蒸餾水定容至1000ml6染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸餾水到100ml3.實(shí)驗(yàn)試劑第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月7分離膠緩沖液Tris6.06gEDTA1.17g定容至100ml8.88上樣緩沖液電泳緩沖液25ml蔗糖10g

0.05％溴酚藍(lán)5ml加蒸餾水至100ml9洗脫液、保存液冰乙酸38ml甲醇125ml蒸餾水338ml第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)方法1.凝膠柱的準(zhǔn)備（1）取一只10cm×0.6cm潔凈﹑干燥的玻璃管，在7cm和8cm兩處做一個記號，一端用封口膜嚴(yán)實(shí)，垂直放好。（2）.按下表配制分離膠溶液試劑分離膠（ml）分離膠緩沖液單體交聯(lián)劑雙蒸水10％過硫酸銨TEMED12.16.80.10.01把分離膠溶液混勻后，用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入7cm高。第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進(jìn)行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，先用習(xí)慣吸去上面的水層，在用濾紙將殘留的水分吸干。2.樣品液制備取正常人血清0.1ml，與1.9ml的上樣緩沖液混合3.裝柱將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)。用微量注射器吸去混合后的樣品液30μl加到分離膠面上（加樣槍不可插入過深，以免刺