特殊毒性及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法-課件

第八章特殊毒性試驗(yàn)及其評(píng)價(jià)第一節(jié)致突變作用及其試驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)第二節(jié)生殖發(fā)育毒性作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)第三節(jié)致癌作用及其試驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)1PPT課件第一節(jié)致突變作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法一、基本概念二、突變類(lèi)型三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制四、致突變?cè)囼?yàn)與致突變作用評(píng)價(jià)2PPT課件

1．DNA與基因DNA由脫氧核糖、磷酸及堿基組成，基本成分為四種核苷酸，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。

遺傳學(xué)基礎(chǔ)3PPT課件

基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能單位，是生物遺傳信息的攜帶者基因組（genome）：細(xì)胞或生物體的一套完整單體的遺傳物質(zhì)4PPT課件

2、染色質(zhì)與染色體

在間期細(xì)胞的細(xì)胞核中，通過(guò)光鏡可見(jiàn)一種能被堿性染料著色的物質(zhì)，即染色質(zhì)。它由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量的RNA組成，形似串珠狀的復(fù)合體。5PPT課件在間期細(xì)胞核中，一般沒(méi)有染色體結(jié)構(gòu)，只有在細(xì)胞分裂時(shí)，染色質(zhì)才螺旋化并折疊成染色體，故染色質(zhì)與染色體是由相同物質(zhì)組成的；染色體存在于細(xì)胞中，通常只有在細(xì)胞分裂時(shí)經(jīng)過(guò)特殊染色才能清楚地看到。6PPT課件2009-6-30染色體與基因有著平行的關(guān)系①染色體可以在顯微鏡下看到。②染色體成對(duì)存在，基因也成對(duì)存在。③個(gè)體中成對(duì)的基因一個(gè)來(lái)自母本，另一個(gè)來(lái)自父本。④不同對(duì)基因形成配子時(shí)的分離與不同對(duì)染色體在減數(shù)分裂期的分離，都是獨(dú)立分配的。7PPT課件3、基因型與表型

基因型指控制生物性狀的基因組成，它是生物體的遺傳組成?；蛐褪切誀畎l(fā)育的內(nèi)因，是表型形成的根據(jù)。表型指在發(fā)育過(guò)程中由基因所控制的生物性狀的具體表現(xiàn)。外界環(huán)境是基因型轉(zhuǎn)變成具體表型的必要條件。8PPT課件細(xì)胞周期指細(xì)胞一次分裂結(jié)束，并開(kāi)始生長(zhǎng)，到下一次分裂終了所經(jīng)歷的過(guò)程。G0：DNA合成前期；

G1：DNA合成期；

S：完成DNA復(fù)制；

G2：為有絲分裂做準(zhǔn)備；

M：有絲分裂期4、細(xì)胞周期、有絲分裂與減數(shù)分裂9PPT課件

有絲分裂過(guò)程有絲分裂指細(xì)胞核分裂的過(guò)程，一個(gè)細(xì)胞由此生成兩個(gè)子細(xì)胞，每個(gè)子細(xì)胞各具有與親代細(xì)胞完全相同的染色體。10PPT課件減數(shù)分裂過(guò)程11PPT課件12PPT課件生物物種可以通過(guò)各種繁殖方式來(lái)保證世代間生命的延續(xù)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為遺傳。遺傳的穩(wěn)定是相對(duì)的。在親子之間或子代個(gè)體之間出現(xiàn)不同程度的差異，這種差異稱(chēng)為變異。一、基本概念13PPT課件造成生物變異的原因有：

①親代個(gè)體雜交產(chǎn)生子體，由于重組而發(fā)生；②由于基因突變而發(fā)生，它是新基因產(chǎn)生的根本來(lái)源；③由于生物的染色體組成或細(xì)胞質(zhì)發(fā)生變化而產(chǎn)生。14PPT課件自發(fā)突變

(spontaneousmutation)

是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然條件下發(fā)生的突變。特點(diǎn)：自發(fā)突變的發(fā)生過(guò)程長(zhǎng)，頻率極低,與物種的進(jìn)化有關(guān)。誘發(fā)突變

(inducedmutation)

是指人為的造成突變。它已被農(nóng)、林、牧、漁業(yè)和園藝學(xué)家利用來(lái)培育和選擇新種或良種。特點(diǎn)：發(fā)生過(guò)程短，頻率高，既可被人類(lèi)利用，也可能對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生危害。遺傳物質(zhì)發(fā)生變化引起遺傳信息的改變，并發(fā)生新的表型效應(yīng)稱(chēng)為突變。15PPT課件突變的分類(lèi)基因突變(genemutation)：一個(gè)或幾個(gè)DNA堿基對(duì)的改變。用光學(xué)顯微鏡觀察不到，必須通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來(lái)判斷。染色體畸變(chromosomeaberration)：染色體的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變，可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。染色體結(jié)構(gòu)改變?nèi)旧w數(shù)目改變16PPT課件二、突變類(lèi)型遺傳毒理學(xué)家主要關(guān)注兩類(lèi)遺傳學(xué)損傷：基因突變?nèi)旧w畸變17PPT課件基因突變一個(gè)或幾個(gè)DNA堿基對(duì)的改變。染色體畸變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)及數(shù)目改變。端粒姊妹染色單體著絲粒組蛋白雙螺旋堿基對(duì)端粒18PPT課件這些損傷多因DNA受損所致，也可能因DNA以外的靶組織受損所致?；蛲蛔?、染色體畸變及染色體數(shù)目變化的本質(zhì)是相同的，其區(qū)別在于受損程度。19PPT課件通常以光學(xué)顯微鏡的分辨率0.2μm來(lái)區(qū)分基因突變和染色體畸變?；蛲蛔兪怯霉鈱W(xué)顯微鏡觀察不到的，須通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育、生化、形態(tài)等表型改變來(lái)判斷，而染色體畸變可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。20PPT課件1.基因突變基因突變指基因中DNA序列的變化。因基因突變限制在一特定的部位，故稱(chēng)為點(diǎn)突變。21PPT課件①堿基置換

指DNA序列上的某個(gè)堿基被其他堿基取代。首先在DNA復(fù)制時(shí)會(huì)使互補(bǔ)鏈的相應(yīng)位點(diǎn)配上一個(gè)錯(cuò)誤的堿基，即發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)。這一錯(cuò)誤配上的堿基在下一次DNA復(fù)制時(shí)卻能按正常規(guī)律配對(duì)，于是一對(duì)錯(cuò)誤的堿基置換了原來(lái)的堿基對(duì)，亦即最終產(chǎn)生堿基對(duì)置換或簡(jiǎn)稱(chēng)堿基置換。

22PPT課件23PPT課件②移碼突變

移碼是DNA中增加或減少了一對(duì)或幾對(duì)不等于3的倍數(shù)的堿基對(duì)所造成的突變。24PPT課件③整碼突變

指在DNA中增加或減少的堿基對(duì)為一個(gè)或幾個(gè)密碼子。④片斷突變

指基因中某些小片斷核苷酸序列發(fā)生改變。這種損傷有時(shí)可跨越兩個(gè)或數(shù)個(gè)基因。片斷突變包括缺失、重復(fù)、重組、重排。25PPT課件2.染色體畸變指染色體的結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常，它是指遺傳物質(zhì)大的改變，一般可用光學(xué)顯微鏡檢查適當(dāng)細(xì)胞有絲分裂中期的染色體來(lái)發(fā)現(xiàn)。26PPT課件（1）染色體結(jié)構(gòu)異常有些畸變是穩(wěn)定的，可通過(guò)重復(fù)細(xì)胞分裂傳給子代。這些畸變?nèi)缛笔?、倒位、重?fù)及平衡易位等，多數(shù)為染色體重排，可在機(jī)體或細(xì)胞群傳遞。27PPT課件容易觀察到的畸變有染色單體斷裂、染色體斷裂、無(wú)中心粒片段、染色單體交換、雙中心粒染色體、環(huán)狀染色體及某些相互易位。28PPT課件染色體畸變裂隙(gap)斷裂(break)斷片(fragment)和缺失(deletion)微小體(minutebody)無(wú)著絲點(diǎn)環(huán)環(huán)狀染色體雙著絲點(diǎn)染色體倒位(inversion)易位(translocation)插入(insertion)和重復(fù)(duplication)輻射體29PPT課件染色體結(jié)構(gòu)變異類(lèi)型染色體缺失,如果蠅的缺刻翅染色體重復(fù),如果蠅的棒狀眼染色體倒位染色體易位,

如夜來(lái)香的變異

30PPT課件在染色體上出現(xiàn)無(wú)染色質(zhì)的區(qū)域，但該區(qū)域兩端的染色體仍保持線(xiàn)狀連接者為裂隙。

指染色體上狹窄的非染色帶，無(wú)線(xiàn)狀連接者為斷裂。帶寬超過(guò)染色單體寬度。①裂隙（gap）和斷裂（break）31PPT課件一個(gè)染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節(jié)段遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)，常將無(wú)著絲粒斷片簡(jiǎn)稱(chēng)為斷片。有著絲粒的部分稱(chēng)為缺失，缺失有末端缺失和中間缺失。②無(wú)著絲粒斷片（fragment）、缺失（deletion）32PPT課件染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒的節(jié)段的兩斷端連接形成一個(gè)環(huán)時(shí)，稱(chēng)為環(huán)狀染色體。③環(huán)狀染色體（ringchromosome）33PPT課件當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次斷裂后，其中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)180再重接，稱(chēng)為倒位。④倒位（inversion）34PPT課件當(dāng)一個(gè)染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來(lái)，稱(chēng)為插入。如果此時(shí)有缺失的染色體和插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發(fā)生于同一位點(diǎn)，則插入將使該染色體連續(xù)出現(xiàn)兩段完全相同的節(jié)段，此時(shí)稱(chēng)為重復(fù)。⑤插入（insertion）和重復(fù)（duplication）35PPT課件兩個(gè)非同源染色體斷裂后，從某個(gè)染色體斷下的節(jié)段接到另一染色體上稱(chēng)為易位。⑥易位（translocation）36PPT課件（2）染色體數(shù)目異常

整倍性畸變：?jiǎn)?、三、四、多倍體

非整倍性畸變：2倍體多一條或少一條或多多條或少多條

2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…

37PPT課件類(lèi)型公式染色體組整倍體單倍體n(ABCD)二倍體2n(ABCD)(ABCD)三倍體3n(ABCD)(ABCD)(ABCD)四倍體4n(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)非整倍體單體2n-1(ABCD)(ABC)三體2n+1(ABCD)(ABCD)(A)四體2n+2(ABCD)(ABCD)(AA)雙三體2n+1+1(ABCD)(ABCD)(AB)缺體2n-2(ABC)(ABC)染色體數(shù)目異常的基本類(lèi)型注：A、B、C、D代表非同源染色體38PPT課件DNA修復(fù)直接修復(fù)切除修復(fù)O6甲基鳥(niǎo)嘌呤修復(fù)光修復(fù)錯(cuò)配堿基修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)復(fù)制后修復(fù)呼救性修復(fù)三、突變的發(fā)生與修復(fù)機(jī)制外源化學(xué)物引起基因突變和染色體突變的靶部位主要是DNA，而導(dǎo)致染色體數(shù)目異常的靶部位主要是有絲分裂和減數(shù)分裂器，如紡錘絲。39PPT課件致突變作用（mutagenesis）：是指外來(lái)因素特別是化學(xué)因子引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的能力，而且此種改變可隨同細(xì)胞分裂過(guò)程而傳遞。致突變物：凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的化學(xué)物質(zhì)或任何環(huán)境因子，又稱(chēng)誘變劑。又稱(chēng)為遺傳毒物。四、致突變?cè)囼?yàn)與致突變作用評(píng)價(jià)40PPT課件觀察化學(xué)毒物致突變作用一般通過(guò)致突變?cè)囼?yàn)來(lái)進(jìn)行。主要目的：①檢測(cè)外源化學(xué)物的致突變性，預(yù)測(cè)其對(duì)哺乳動(dòng)物和人的致癌性；②檢測(cè)外源化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的遺傳毒性，預(yù)測(cè)其對(duì)人體的遺傳危害性。41PPT課件觀察項(xiàng)目的選擇基因突變和染色體畸變的檢測(cè)可直接反映化學(xué)物的致突變性，是評(píng)價(jià)化學(xué)物致突變性唯一可靠方法。但是還有許多試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象并不直接反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，僅反映致突變過(guò)程中發(fā)生的其他事件。將試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱(chēng)為遺傳學(xué)終點(diǎn)(geneticmdpoint)。42PPT課件正常DNADNA損傷DNA修復(fù)過(guò)程未修復(fù)的DNA損傷表達(dá)斷裂的DNA分子染色體結(jié)構(gòu)異?；蛲蛔兗?xì)胞死亡非整倍體多倍體重組事件

SCE有絲分裂性交換染色體分離異常細(xì)胞屏障遺傳毒物無(wú)誤修復(fù)易錯(cuò)修復(fù)細(xì)胞分裂突變發(fā)生中的事件及遺傳學(xué)終點(diǎn)的關(guān)系43PPT課件常用的致突變?cè)囼?yàn)1、細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)3、果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)4、染色體畸變分析5、微核試驗(yàn)6、姐妹染色單體交換試驗(yàn)7、顯性致死試驗(yàn)8、小鼠可遺傳易位試驗(yàn)9、細(xì)菌DNA修復(fù)試驗(yàn)10、程序外DNA合成實(shí)驗(yàn)11、精子畸形試驗(yàn)12、小鼠特異基因座試驗(yàn)44PPT課件45PPT課件致突變?cè)囼?yàn)組合的原則一組可靠的試驗(yàn)系統(tǒng)應(yīng)包括每一類(lèi)型的遺傳學(xué)終點(diǎn)。如細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、微核試驗(yàn)、染色體畸變分析和姐妹染色單體交換試驗(yàn)，這一組試驗(yàn)包括主要類(lèi)型遺傳學(xué)終點(diǎn)。體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。一般體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)取長(zhǎng)補(bǔ)短，綜合考慮。配套實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種。如原核細(xì)胞、低等和高等真核細(xì)胞，這樣更加具有說(shuō)服力。46PPT課件以營(yíng)養(yǎng)缺陷的突變體菌株為試驗(yàn)系統(tǒng)，觀察受試物引起其回復(fù)突變的作用。試驗(yàn)菌株： 鼠傷寒沙門(mén)氏菌——Ames試驗(yàn) 大腸桿菌——大腸桿菌回復(fù)試驗(yàn)1、細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)47PPT課件Ames試驗(yàn)原理：檢測(cè)受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株(his-)回復(fù)突變成野生型(his+)的能力。試驗(yàn)菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上不能生長(zhǎng)。48PPT課件鼠傷寒沙門(mén)氏菌原養(yǎng)型(his+)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株(his-)正向突變回復(fù)突變代謝活化系統(tǒng)受試物49PPT課件有點(diǎn)試驗(yàn)和摻入試驗(yàn)兩種。應(yīng)分別進(jìn)行不加及加代謝活化系統(tǒng)的試驗(yàn)，常用為S9混合液，即用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿經(jīng)9000g離心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等輔助因子。50PPT課件Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌株有四種：TA97和TA98檢測(cè)移碼突變，TA100檢測(cè)堿基置換突變，TA102對(duì)醛、過(guò)氧化物和DNA交聯(lián)劑較敏感。這四個(gè)試驗(yàn)菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，檢測(cè)時(shí)提高試驗(yàn)敏感性。Ames試驗(yàn)的方法有平板摻入法，點(diǎn)試法及預(yù)培養(yǎng)法等。51PPT課件

突變型試驗(yàn)菌株可被各種誘變因素誘導(dǎo)，回復(fù)突變成野生型(his+)

，即恢復(fù)了合成組氨酸的能力，可在此平板上生長(zhǎng)成可見(jiàn)菌落。如果受試物處理組回變菌落數(shù)顯著超過(guò)陰性對(duì)照組；并有劑量反應(yīng)關(guān)系，即可判定受試物為鼠傷寒沙門(mén)菌的致突變物。52PPT課件結(jié)果判斷只要一種試驗(yàn)菌株得到陽(yáng)性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物。僅四種菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物。不加S9混合液得到陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明受試物是直接致突變物。加S9混合液才得到陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明受試物是間接致突變物。53PPT課件哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)是利用嚙齒類(lèi)和人體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變?cè)囼?yàn)。

常用細(xì)胞株選用的基因座小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y）TK、HPRT

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織細(xì)胞（CHO）HPRT

中國(guó)倉(cāng)鼠肺組織細(xì)胞（V79）HPRT

人淋巴細(xì)胞HPRT

2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)(mammaliancellgenemutationassay)54PPT課件TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脫氧核苷＋ATP→胸苷酸。存在嘧啶類(lèi)似物5-溴脫氧尿苷時(shí)，產(chǎn)生異常核苷酸使細(xì)胞死亡。受試物存在時(shí)若細(xì)胞不死亡說(shuō)明TK發(fā)生突變。（1）TK基因座55PPT課件次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶：催化次黃嘌呤＋鳥(niǎo)嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-單磷酸（NMP），補(bǔ)充途徑。如存在堿基類(lèi)似物，生成相應(yīng)的NMP，摻入到DNA中可致死。加入受試物后能存活的細(xì)胞表示發(fā)生基因突變——HPRT-。（2）HPRT基因座56PPT課件制備細(xì)胞分裂中期相染色體標(biāo)本，在光鏡下可直接觀察染色體的數(shù)目和形態(tài)的改變。染色體畸變?cè)囼?yàn)也常稱(chēng)為細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)(cytogeneticassay)。染色體畸變?cè)囼?yàn)可為體外試驗(yàn)，也可為體內(nèi)試驗(yàn)，包括對(duì)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分析。3.染色體畸變?cè)囼?yàn)57PPT課件體內(nèi)試驗(yàn)：多觀察骨髓細(xì)胞，其分裂旺盛、易于獲得和制備，優(yōu)勢(shì)在于可體現(xiàn)哺乳動(dòng)物的代謝過(guò)程、DNA修復(fù)和藥物動(dòng)力學(xué)特征。但應(yīng)注意受試物或其活性代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。58PPT課件體外試驗(yàn)：常用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(CHL)，以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和V79等細(xì)胞系，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗(yàn)中，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用原代或早代細(xì)胞。59PPT課件2009-6-30上一內(nèi)容回主目錄返回下一內(nèi)容返回

上一內(nèi)容下一內(nèi)容回主目錄60PPT課件試驗(yàn)步驟染毒：健康成年ICR小鼠，實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)予環(huán)磷酰胺40mg/kg體重腹腔注射。收獲細(xì)胞：處死動(dòng)物前2~4h，秋水仙堿4mg/kg腹腔注射。小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸NS約5ml插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，吸管吹打骨髓團(tuán)塊混勻，以1500r/min離心10min，棄上清液。低滲：打散沉淀物，加入預(yù)溫37℃的0.075mol/LKCl約6ml，混勻，于37℃低滲15~20min，再加固定液l~2ml混勻，立即以1000r/min離心10min，棄上清液。61PPT課件固定：重懸細(xì)胞，加入固定液4ml混勻，放置室溫10~20min，然后1000r/min離心10min，去上清液。同樣方法再固定一次，棄上清液，留約0.5ml。制片染色：使細(xì)胞懸浮，用吸管吸取細(xì)胞懸液，距預(yù)冰凍的載波片10~15Cm高處滴片，干燥，用10％Giemesa染色液染色10~20min，輕微沖洗，自然晾干。閱片計(jì)數(shù)。62PPT課件染色體數(shù)目改變包括：整倍體變異：原先2n的染色體變?yōu)槎啾扼w如3n或4n等。非整倍體變異：染色體組中的個(gè)別染色體增加或減少。染色體結(jié)構(gòu)改變包括：裂隙(G)、斷裂(B)、碎片(F)、環(huán)形(r)、交換(E)以及復(fù)合性斷裂等。小鼠和大鼠的染色體核型都為近端著絲點(diǎn)型。小鼠的染色體數(shù)為40條，大鼠的染色體數(shù)為42條。讀片時(shí)每張標(biāo)本片至少要分析100個(gè)中期分裂細(xì)胞。63PPT課件64PPT課件染色體的斷片或遲滯的染色體在細(xì)胞分裂后期，由于不能進(jìn)入子細(xì)胞的核中而在間期的子細(xì)胞胞漿內(nèi)形成的游離團(tuán)塊物質(zhì)，它與細(xì)胞主核著色一致，圓形或橢圓形。4、微核（micronucleus）試驗(yàn)65PPT課件66PPT課件無(wú)核細(xì)胞紅細(xì)胞有核細(xì)胞中微核難與正常核分葉及核突出物區(qū)別微核試驗(yàn)67PPT課件常用嚙齒類(lèi)動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)或外周血細(xì)胞進(jìn)行微核試驗(yàn)。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，微核容易辯認(rèn)，PCE胞質(zhì)含RNA染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故為骨髓微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。一般采用多次染毒后24h采樣。68PPT課件紅細(xì)胞的分化成熟過(guò)程69PPT課件70PPT課件71PPT課件MNNCEIllustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold72PPT課件試驗(yàn)步驟健康成年ICR小鼠，實(shí)驗(yàn)前24h予環(huán)磷酰胺40mg/kg腹腔注射染毒。小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，然后用吸管吹打骨髓團(tuán)塊混勻。以1000r/min速度離心10min，棄上清液，留下約0.5ml沉淀物混勻后，滴片兩張，推片。將推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。將固定晾干后的骨髓片，用Giemsa應(yīng)用液染色10~15min，輕微沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)微核率。73PPT課件PCE呈灰藍(lán)色，成熟RBC呈粉紅色，NC呈藍(lán)紫色。PCE中含有的微核大小為細(xì)胞直徑的1/20-1/5，呈圓形或橢圓形，邊緣光滑整齊，染色性與細(xì)胞核一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核。每張片計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)。微核率（‰）=含微核PCE細(xì)胞數(shù)PCE細(xì)胞總數(shù)×100074PPT課件Giemsa染色PCE胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，染色呈灰藍(lán)色；MCN多數(shù)為圓形，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色NCE的核糖體已消失，被染成淡桔紅色。NCEPCE&MCN75PPT課件結(jié)果分析與評(píng)價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)：正常PCE/NCE比值約為l（正常范圍為0.6～1.2）；如PCE/NCE＜0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如PCE/NCE＜0.05，則表示受試化學(xué)毒物的劑量過(guò)大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。76PPT課件77結(jié)果示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中一個(gè)微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多染紅細(xì)胞（NCE）77PPT課件78示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中兩個(gè)微核（MN）78PPT課件79示小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞中多個(gè)微核（MN）79PPT課件

顯性致死指發(fā)育中的精子或卵子細(xì)胞發(fā)生遺傳學(xué)損傷，導(dǎo)致受精卵或發(fā)育中的胚胎死亡。一般認(rèn)為顯性致死主要是由于染色體損傷的結(jié)果。顯性致死試驗(yàn)以胚胎死亡為觀察終點(diǎn)，用于檢測(cè)受試物對(duì)動(dòng)物性細(xì)胞的染色體損傷作用。一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接觸受試物，然后使之與未染毒的雌性交配，觀察胚胎死亡情況。計(jì)算出受孕率、總著床數(shù)、早期和晚期胚胎死亡率予以評(píng)價(jià)。5.顯性致死試驗(yàn)(dominantlethalassay)80PPT課件6.程序外DNA合成試驗(yàn)(unscheduledDNAsynthesistest，UDS)

當(dāng)DNA受損后，DNA的修復(fù)合成