熱力滅菌基礎(chǔ)

TOC\o"1-5"\h\z熱對(duì)活細(xì)胞的作用 1影響滅菌效果的因素 2\o"CurrentDocument"物理/化學(xué)條件 2相對(duì)濕度 3曝?zé)釙r(shí)間 3熱力滅菌的對(duì)數(shù)規(guī)則 3滅菌機(jī)理 3\o"CurrentDocument"對(duì)數(shù)規(guī)則的數(shù)學(xué)模式 3滅菌工藝有關(guān)參數(shù)及其相關(guān)性 4D值一微生物耐熱參數(shù) 4\o"CurrentDocument"Z值一滅菌溫度系數(shù) 6F值一TC滅菌時(shí)間 8TF值一標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間 90\o"CurrentDocument"滅菌率L 9無菌標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)學(xué)模式 11D值測(cè)定法 12不生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)法 12存活曲線法 13\o"CurrentDocument"對(duì)數(shù)規(guī)則在非濕熱滅菌領(lǐng)域的應(yīng)用 14干熱滅菌 15干熱去熱原 15第五篇熱力滅菌基礎(chǔ)與無菌保證中國(guó)藥典200（版在通則附錄河11中收載了滅菌法，為我國(guó)制藥業(yè)采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)增添了新的篇章，也為滅菌的半定量控制納入了定量控制軌道確立了法定依據(jù)。和歐美的藥典一樣，我國(guó)藥典收載的滅菌法中包括了濕熱滅菌法、干熱滅菌法、濾過滅菌法、輻射滅菌法及環(huán)氧乙烷滅菌法。本篇只討論熱力滅菌的動(dòng)力基礎(chǔ)、無菌保證及常用滅菌設(shè)備三個(gè)方面，為讀者理解熱力滅菌原理、理解無菌保證要求、選用滅菌設(shè)備、制訂驗(yàn)證方案、實(shí)施驗(yàn)證等方面提供必要的基礎(chǔ)資料。第一章熱力滅菌基礎(chǔ)熱對(duì)活細(xì)胞的作用熱力滅菌是研究最深、使用最廣的滅菌方式。當(dāng)溫度超過細(xì)胞最佳生理活動(dòng)的溫度范圍時(shí)，隨著溫度的升高，細(xì)胞代謝減緩，細(xì)胞的生長(zhǎng)及繁殖最終停止。每種細(xì)胞的生理活動(dòng)的溫度均有一上限，一旦溫度超過它的上限，起生命作用的蛋白質(zhì)、酶及核酸會(huì)被永久性破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡。從微觀上看，不具備真正核膜結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞（如細(xì)菌和藍(lán)綠藻）耐熱性最強(qiáng)。某些嗜熱性細(xì)菌甚至可在80C以上的高溫中存活。但是，絕大多數(shù)生長(zhǎng)態(tài)菌在80?100C下即可被迅速殺滅。具備核膜結(jié)構(gòu)的真核微生物，如真菌和原生動(dòng)物，在60?80°C下就可被迅速殺滅。多數(shù)病毒的耐熱較差，只有乙肝病毒（HBV）例外，它要在75C下至少曝?zé)?分鐘才能被滅活。還有一些其它類型的生物體也具有較強(qiáng)的耐熱性。例如，痙攣性假麻痹癥*的蛋白侵襲子（prion）病原體，它既不屬細(xì)胞型微生物也不屬病毒，需要在132C下加熱一小時(shí)才可完全殺滅；而在細(xì)菌中，需氧菌中的芽抱桿菌屬（Bacillu）和厭氧菌中的梭狀芽抱桿菌屬（Clostridium，也具有較強(qiáng)的耐熱性。這些細(xì)菌的細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源性抱子（芽抱）或胞間休眠體，一旦形成這種狀態(tài)，它們對(duì)熱、干燥及化學(xué)消毒劑的耐受性增強(qiáng)。要想殺滅這類芽抱，使之下降一個(gè)數(shù)量級(jí)（對(duì)數(shù)單位），干熱滅菌的溫度必須達(dá)到100?170C，濕熱滅菌的溫度在80?129C之間。如以干熱滅菌及濕熱滅菌的滅菌率L（lethality）來計(jì)算，芽抱被殺滅困難的程度比其生長(zhǎng)態(tài)時(shí)增大了104?105倍。細(xì)菌芽抱的耐熱性與多種因素有關(guān)，有些因素尚沒被人們完全認(rèn)識(shí)。芽抱形成時(shí)，細(xì)菌停止生化反應(yīng)，并將遺傳物質(zhì)包藏在芽抱中。此過程中發(fā)生了一系列生理變化：細(xì)胞質(zhì)大量脫水，體積變小，在變小的原生質(zhì)體周圍形成了一層厚殼，此過程中，還生成了一種特殊化學(xué)物質(zhì)一吡啶二羧酸或DPA（吡啶-2,6-二羧酸）。在芽抱形成階段，吡啶二羧酸鈣能與脫氧核糖核酸（DNA）以及細(xì)胞內(nèi)的酶形成復(fù)合物，從而對(duì)休眠狀態(tài)的芽抱起保護(hù)作用。處于休眠狀態(tài)的芽抱可以存活很多年，在適宜的條件下，它們?cè)跀?shù)分鐘內(nèi)即可恢復(fù)到生長(zhǎng)狀態(tài)。*Creutzfekldt-Jakob，克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布綜合癥，一種罕見的、有傳染性的致命性腦病。影響滅菌效果的因素2.1物理/化學(xué)條件在細(xì)菌形成芽抱過程中的多種環(huán)境因素會(huì)影響抱子的耐熱性。例如，溫度較高并有二價(jià)陽離子（如Ca2+、FeeMg2+、Mm+）存在時(shí)，芽抱的耐熱性增強(qiáng)；與此相反，當(dāng)pH值超出6.0?8.0的范圍時(shí)，或在高濃度的鹽水或磷酸鹽中形成芽抱時(shí)，其耐熱性下降。自然界中芽抱的耐熱性與環(huán)境條件相關(guān)，如溶液濃度、水份（相對(duì)平衡濕度a）、pH值、對(duì)芽抱有損傷作用的物理因素以及對(duì)芽抱有抑制作用的化學(xué)品等，它們均會(huì)影響芽抱的耐熱性。包藏在晶體或有機(jī)物內(nèi)的芽抱，其耐熱性通常明顯高于一般非包藏態(tài)的芽抱。因此，在某一溫度條件下，將泥土包藏性芽抱和從泥土分離并培養(yǎng)得到的芽抱同時(shí)滅菌時(shí)，要想獲得相同的滅菌效果，同一滅菌溫度下，前者所需的滅菌時(shí)間比后者要高出十多倍。由于被滅菌品受到了泥土中芽抱的污染，如在運(yùn)輸處理中被未經(jīng)過濾空氣微粒所致的污染，或者由人員或其它物品接觸遭受污染時(shí)，要將芽抱完全殺滅會(huì)很困難，正因?yàn)槿绱?，GMP要求采取一切必要的措施防止污染。2.2相對(duì)濕度在熱力滅菌中，水對(duì)殺滅細(xì)菌芽抱起著重要作用。與水相關(guān)的滅菌方式只有兩種：濕熱和干熱。濕度達(dá)到飽和［相對(duì)濕度（RH）為100%（或a=1.0）］時(shí)的滅菌方式稱為濕熱滅w菌；相對(duì)濕度低于100%條件下的滅菌方式統(tǒng)稱干熱滅菌。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，溫度在90?125°C之間，相對(duì)濕度在20?50%時(shí)，細(xì)菌芽抱較難殺滅；當(dāng)相對(duì)濕度高于50%或低于20%時(shí)，則較易殺滅。這對(duì)選擇滅菌條件具有指導(dǎo)意義。2.3曝?zé)釙r(shí)間滅菌過程中，原核細(xì)胞的死亡（被殺滅）遵循一級(jí)反應(yīng)的規(guī)則。溫度與某一時(shí)間芽抱存活對(duì)數(shù)間的關(guān)系，在許多情況下呈線性。這就是說，在特定的滅菌溫度下，任一時(shí)間抱子死亡僅與這個(gè)時(shí)間抱子的濃度相關(guān)，而使抱子數(shù)下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需時(shí)間并不受抱子原始濃度的影響。本篇第二章中將對(duì)此作專門討論。熱力滅菌的對(duì)數(shù)規(guī)則3.1滅菌機(jī)理組成細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子的功能取決于它的特殊結(jié)構(gòu)，在一定高溫條件下受熱時(shí)白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵發(fā)生斷裂影響了分子空間構(gòu)型的重排，從而導(dǎo)致微生物的死亡。對(duì)這一課題進(jìn)行的大量的研究表明，細(xì)菌抱子，尤其是芽抱桿菌和梭狀芽抱具有耐熱性。耐熱抱子的破壞取決于在水份條件下抱子的水合作用以及核酸和蛋白質(zhì)的變性。因此，蒸汽滅菌中使用飽和蒸汽是至關(guān)重要的。飽和蒸汽的穿透性比干熱空氣及過熱蒸汽的穿透性要強(qiáng)得多。蒸汽冷凝時(shí)放出的潛熱卡/克）傳給被滅菌品，使之升溫并使被滅菌品所帶的微生物尤其是表面微生物發(fā)生水合作用，從而加速了他們的死亡。3.2對(duì)數(shù)規(guī)則的數(shù)學(xué)模式長(zhǎng)期以來，人們進(jìn)行了大量的探索及研究工作，以解決蒸汽滅菌無定量標(biāo)準(zhǔn)的難題。研究的對(duì)象主要是耐熱抱子，因?yàn)樯L(zhǎng)態(tài)菌在滅菌過程中很容易被殺滅。研究的課題是在蒸汽滅菌過程中，微生物的死亡被殺滅）所遵循的規(guī)律。研究的結(jié)果表明，將活的微生物看作反應(yīng)物，并將殺滅后的微生物看作生成物，抱子的死亡基本符合質(zhì)量作用定律。因?yàn)檫@一研究以阿倫尼烏斯一級(jí)反應(yīng)為基礎(chǔ)，故被認(rèn)為是經(jīng)典理論。濕熱滅菌的對(duì)數(shù)規(guī)則始^921年Bigeowg表的論玄-用對(duì)數(shù)規(guī)則闡述滅菌工藝過程，Rahn等人對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)的研窕，使對(duì)數(shù)規(guī)則更系統(tǒng)化了。按照他們的理論，滅菌時(shí)微生物的死亡遵循對(duì)數(shù)規(guī)則，滅菌過程可以用阿倫尼烏斯rrhenius的一級(jí)反應(yīng)式來描述。根據(jù)質(zhì)量作用定律，在恒定溫度及保持其它條件不變的情況!單位時(shí)間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于時(shí)原有0的數(shù)目，即：dN/dUK（N—Nk） （2）0式中：N0為t=0時(shí)，存活的微生物數(shù)；

Nk為t時(shí)被殺滅的微生物數(shù)；N為t時(shí)存活的微生物數(shù)。如果把普通座標(biāo)換成半對(duì)數(shù)座標(biāo)，則可得到一直線，見圖.4將(2)積分得到：LgNt=LgNj-(K/2.303)t ⑶圖5.1微生物存活數(shù)與滅菌時(shí)間關(guān)系圖 圖5.2微生物存活數(shù)對(duì)數(shù)與滅菌時(shí)間的關(guān)系3.3滅菌工藝有關(guān)參數(shù)及其相關(guān)性3.3.1D值--生物耐熱參數(shù)系指一定溫度下將微生物殺滅0城使之下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需的時(shí)「盼)。D值的大小直觀地反映了微生物的熱耐受性，中國(guó)藥典附錄滅菌法中耐熱參數(shù)的提法由此而定。有的學(xué)者曾將。值譯作九成殺滅時(shí)間，內(nèi)涵并無差異。按。的定義，將t=D，Nt=1/10N代入⑶式并化簡(jiǎn)：0(K/2.303)=lgN)-lgNt=lgN/Nt=lg10=1?.?D=-2.303/K艮股。是直線方程(3)斜率的負(fù)倒數(shù)』值越大，該溫度下微生物的耐熱性就越強(qiáng)，在滅菌中就越難殺滅。對(duì)某一種微生物而言，在其他條件保持不變的情況下,隨滅菌溫度的變化而變化。

圖5.3D直定義圖滅菌溫度升高時(shí)，直線方程3）的斜率變大，即使微生物殺滅0%所需的時(shí)間就短。圖5.4直與滅菌溫度關(guān)系圖USP24I攵載的生物指示劑嗜熱脂肪桿菌B.Stearothermophili的）孢子在121°C下的0值在1.5-3分鐘之間。不同溫度下，不同的微生物在不同的環(huán)境條件下具有各不相同的，這可以從表4.1.2匯總的數(shù)據(jù)看出。表5.1.2不同滅菌溫度下的值[4]

微生物名稱溫度。C介質(zhì)D值(分)嗜熱脂肪桿菌105葡萄糖87.8嗜熱脂肪桿菌110葡萄糖32.0嗜熱脂肪桿菌115葡萄糖11.7嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖2.4嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖乳酸林格氏液2.1嗜熱脂肪桿菌121注射用水3.0梭狀芽抱桿菌105葡萄糖1.3梭狀芽抱桿菌105注射用水13.7梭狀芽抱桿菌105注射用水2.1Z值一滅菌溫度系數(shù)Z值系指使某一種微生物的值變化一個(gè)對(duì)數(shù)單位，滅菌溫度應(yīng)升高或下降的度數(shù)。在滅菌溫度不大的變化范圍內(nèi)，溫度和D的對(duì)數(shù)值之間可設(shè)定為線性函數(shù)。于是有:TOC\o"1-5"\h\zlgD=lgD+S(T-T) (4)2 1 2 1式中：S為Slop為方程(4)的斜率；D及D分別為T和T度下的)值。1 2 1 2不難看出，Z是直線方程(4)斜率的負(fù)倒數(shù)，即：Z=(T-T)/(lgD-lgD)1 2 2 1圖5.5Z值定義圖不同的微生物抱子，在不同的溶液中有各不相同值。

同種抱子詼值在不同溶液中亦有差異。表1.:列舉了嗜熱脂肪桿菌在不同溶液中的值。表5.1.3嗜熱脂肪桿菌在不同溶液中的值[5]溶液Z值葡萄糖水溶液10.3注射用水8.4葡萄糖乳酸林格氏液11.3pH7W酸鹽緩沖液7.6平均9.4在沒有特定要求時(shí)，Z值通常都取10,以簡(jiǎn)化計(jì)算。Z值被用于定量地描述抱子對(duì)滅菌溫度變化的敏感程度值越大，抱子對(duì)溫度變化的敏感性越弱，此時(shí)，企圖通過升高滅菌溫度的方式來加速殺滅微生物的收效就不明顯。這可通過下表及按表所作的囹.1.8來理解。不同2值下，D121=1.5的抱子在不同溫度下的值表滅菌溫度°CZ=7CZ=10CZ=12CD/mimlgDD/mimlgDD/mimlgD105300.002.47760.001.78832.611.51311057.691.76118.991.27812.401.09311510.971.0335.970.7764.750.6761202.080.3181.890.2761.820.2601211.500.1761.500.1761.500.176按表中數(shù)據(jù)，可得值與滅菌溫度關(guān)系圖。圖5.6Z值與滅菌溫度關(guān)系圖如果Z=10°C，貝1]110^下的0值為18.99分。Z=7°C時(shí)，直線的斜率增大，此時(shí)值升到57.67分鐘。當(dāng)Z=12C時(shí)，情況正相反,0值降至12.38分鐘。當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，這三種微生物抱子相應(yīng)）值變化幅度隨值的增大而減少的趨勢(shì)是顯而易見的。3.3.3F值--TC滅菌時(shí)間TF值指^c滅菌值系指一個(gè)給定值下,滅菌程序在溫度tc下的等效滅菌時(shí)間。TFt=DT^AlgN （5）式中次為在^下微生物的）值；T△lgN為TC下滅菌程序使微生物數(shù)下降的對(duì)數(shù)單位數(shù)。如果△=]，則Ft=Dt，當(dāng)藥液滅菌前微生物總數(shù)為。時(shí)，則在也將其全部殺滅至0所需的時(shí)間^^T=DT^lgNoo因此可以把F理解為TC滅菌值，即滅菌程序賦予被滅菌品彼下的滅菌時(shí)間S12.9）。低于121C滅菌的T程序在企業(yè)并不少見，特別是小容量注射劑，有些品種只能05C滅菌30分鐘，當(dāng)人們誠(chéng)為10530分鐘時(shí)，應(yīng)當(dāng)包括了升溫及降溫對(duì)殺滅微生物所起的熱效應(yīng)，因此滅菌程序的保溫時(shí)間實(shí)際不足30分鐘。由于。值隨滅菌溫度的變化而變化，所以不同溫度下達(dá)到相同滅菌效果時(shí)值將隨）值變T化而變化。滅菌溫度高時(shí)，所需的C滅菌時(shí)間就短；滅菌溫度較低時(shí)，則所需TC滅菌時(shí)間就長(zhǎng)。3.3.4F值一標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間0在FDA的大容量注射^GMP草案中，F(xiàn)o系滅菌過程賦予一個(gè)產(chǎn)品21°C下的等效滅菌時(shí)間。BP199對(duì)F的定義是：將!2況及Z=10C作為參照標(biāo)準(zhǔn)仃。系指被滅菌品在滅菌過程中獲得參0照標(biāo)準(zhǔn)條件下相同滅菌效果的曝?zé)釙r(shí)間因此，應(yīng)當(dāng)把21C理解為標(biāo)準(zhǔn)滅菌溫度,F。則是標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間，要是沒有標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)滅菌程序作量化的比較就無從談起。3.3.5滅菌率LL指在某一溫度TC)下滅菌一分鐘所獲得的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間沒有單位。現(xiàn)討論標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間F。與和TC滅菌時(shí)間之間的關(guān)系。T從⑷式已知TOC\o"1-5"\h\zZ=(T-T)/(lgD-lgD)1 2 2 14T2=121C, T1=T代入上式Z=(T-121)/(lgD-IgD) (6)121TlgD12-lgD=lg(D2/DT)=(T-121)/ZD121/Dt=10(t-121)/z (7)從3.3節(jié)⑸式FT=DT^AlgNF0=D121^AlgN (8)Ft=Dt^AlgN (9)達(dá)到同樣滅菌效果時(shí)，⑻(9^^lgN等值。F0/Ft=D]21/Dt=10(T-121)/Z滅菌率L=10(T-121)/Z=F0/Ft (10)上式中通常取=10C

表4.1.例舉了Z=10°C時(shí)不同溫度下的滅菌率值比較110°C和121°C的滅菌率可以得出結(jié)論：--110C滅菌12.6分鐘和121C滅菌1分鐘等效。—滅菌時(shí)間相等時(shí)，110C滅菌效果只有!21^下滅菌效果的.9%。表4.1.4=10C時(shí)，不同溫度下的滅菌率和21C下滅菌1分鐘時(shí)所相當(dāng)?shù)腲滅菌時(shí)間溫度TC滅菌率L=Fo/FT=D12/dt121C下滅菌1分鐘時(shí)所相當(dāng)?shù)腡C滅菌時(shí)間F=F/L1211.00 T 0 1.001200.7941.2591180.5011.9951160.3163.1621140.1995.0121120.1267.9431100.07912.600說明116C下滅菌1分鐘對(duì)芽抱殺滅效果只有標(biāo)準(zhǔn)滅菌狀態(tài)下的32%；110C下1分鐘，僅為標(biāo)準(zhǔn)滅菌狀態(tài)下的7.9%。121C下滅菌!分鐘相當(dāng)于110CT滅菌!2.6分鐘；112燈下滅菌\943分；114C下滅菌5.012分鐘。4L86圖5.8溫度和滅菌率之間的關(guān)系21004L86圖5.8溫度和滅菌率之間的關(guān)系2100T/C110 120 1305.10溫度和滅菌率之間的關(guān)系不同溫度，不同值下的滅菌率（Lethalrate見附表4.1低溫度和滅菌率之間的關(guān)系可以用圖8來說明。溫度低于100C時(shí)，滅菌率/氐得幾乎可忽略不計(jì)，隨著滅菌溫度的上升L值變大。在超過121C時(shí)，L值隨溫度上升急劇增加。根據(jù)這一原理，當(dāng)被滅菌品為手術(shù)刀、不銹鋼器具時(shí)，通常采用高溫滅菌法，溫度可超過21°C，以縮短滅菌時(shí)間；對(duì)藥物產(chǎn)品而言，過高的溫度容易造成產(chǎn)品降解或穩(wěn)定性方面問題，一般不采用超MC的滅菌溫度。3.3.6無菌標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)學(xué)模式我國(guó)及歐、美藥典都把無菌保證值不得大于百萬分之一作為最終滅菌產(chǎn)品無菌保證的要求[7]，在文字說明中，常用terilityAssuranceLevel(SM1)06的提法，但在F計(jì)算時(shí)，則使用0以下定義：TOC\o"1-5"\h\zSAL無菌保證值=lg(微生物存活幾率 (11)藥典對(duì)最終滅菌的要求賦予對(duì)數(shù)規(guī)則以新的內(nèi)涵，它的數(shù)學(xué)模式也因此發(fā)生了變化。設(shè)濕熱滅菌產(chǎn)品微生物存活概率為，產(chǎn)品滅菌前初始污染菌數(shù)為0,污染菌的耐熱參數(shù)為t，這些參數(shù)與滅菌時(shí)間F之間存在如下關(guān)系式： ° TTlgP=lgN°—FT/DT (12)化簡(jiǎn)得：FT/DT=lgN0—lgPFt=(lgN°—lgP)DT 把P=10-6代入Ft=Dt*lgN0+6*Dt (13)6*Dt=Ft—Dt*lgN0 (14)如果所選用的滅菌溫度為121.1C，那么，(14)式中TC滅菌時(shí)間用F來表示，微生物0耐熱參數(shù)應(yīng)使用D⑵，從(14)可得到以下藥典無菌保證通用表示式：F0N6*D121+D121*lgN0或 (F0—D121*lgN0)/D121A6 (15)從(15)可以看出F從二個(gè)方面對(duì)產(chǎn)品的無菌保證作出貢獻(xiàn)一是將抱子殺滅至仇(圖04.1.11A)二是為產(chǎn)品提供無菌保證值圖4.1.1中B)，使抱子存活的概率再下降個(gè)對(duì)數(shù)單位，F(xiàn)DA將SAL稱為最低安全系數(shù)aminimumsafetyfactor)，一只說明了它的安全性，二則表明它是最終滅菌產(chǎn)品無菌保證的最低要求。90%90%W御圖5.9理想滅菌過程示意圖3.4D值測(cè)定法3.4.1不生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)法在注射劑協(xié)會(huì)及藥品生產(chǎn)企業(yè)協(xié)會(huì)〈干熱滅菌及去熱原驗(yàn)證＞(專題技術(shù)報(bào)告3)對(duì)D值的測(cè)定已有詳細(xì)闡述。不生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)法又稱陰性分?jǐn)?shù)法，D值測(cè)試需專用特殊設(shè)備，如生物指示劑耐熱性測(cè)定儀(BIERvessel)，它在滅菌過程中形成矩形脈沖曲線，即升溫及降溫極快，能保持恒定的溫度，曝?zé)徇^程容易計(jì)時(shí)。此測(cè)定法的假設(shè)條件是：微生物存活數(shù)從N到滅菌終點(diǎn)始終與曝?zé)釙r(shí)間呈線性關(guān)系(對(duì)數(shù)規(guī)則)。實(shí)驗(yàn)的具體方法有二種。一種稱0最可能數(shù)測(cè)定法(Mostprobablenumbermethod)，僅需一次加熱就可估算出D值。將一組樣品(至少10個(gè)樣本)置于設(shè)定滅菌溫度下，加熱到設(shè)定時(shí)間后，取出并分別作無菌檢查。該方法檢測(cè)靈敏度高于平板計(jì)數(shù)法。當(dāng)滅菌溫度T為121°C時(shí)，可用下式計(jì)算D值：Dt=F/lgN0—lg(2.303lgn/q) (16)其中，n指樣品總數(shù)q指曝?zé)崽幚砗蟮臒o菌樣品數(shù)。另一種方法實(shí)驗(yàn)時(shí)每組至少需要10個(gè)樣品，將其置于預(yù)定溫度下，設(shè)置不同的曝?zé)釙r(shí)間，但曝?zé)岬臅r(shí)間間隔相同，熱處理后，將樣品取出，放入無菌液體培養(yǎng)基中，于適宜溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，記錄每組樣品中沒有微生物生長(zhǎng)的樣品數(shù)，并按表1進(jìn)行排列。表4.1.5：陰性分?jǐn)?shù)法估算D值［每組中無微生物生長(zhǎng)樣品數(shù)(f)/每組樣品數(shù)(n)］表121C下的曝?zé)釙r(shí)間(分鐘)357911131517f/n0/100/101/103/105/107/1010/1010/10f(陰性樣品麴_0135710_選擇從全部生長(zhǎng)(0/10)的最長(zhǎng)曝?zé)釙r(shí)間到顯示完全不生長(zhǎng)(10/10)的最短曝?zé)釙r(shí)間之間的數(shù)據(jù)計(jì)算D值。從表中可知，本次試驗(yàn)中的兩個(gè)時(shí)間分別是5分鐘和15分鐘。抱子完全殺滅(存活抱子數(shù)小于1)時(shí)間(T)可用下式計(jì)算：T=Tk—d/2—(d/10xf) (17)其中，二指陰性分?jǐn)?shù)范圍的下限(全部樣品不長(zhǎng)菌所需的最短曝?zé)釙r(shí)間)d指曝?zé)釙r(shí)間間隔由表1數(shù)據(jù)計(jì)算，得到T=15—1—(2/10x26)=8.8分鐘然后，按下式計(jì)算D值：

D=T/(lgN0+0.2507) (18)假設(shè)N0=105，則D=8.8/(5+0.2507)=1.7分鐘3.4.2存活曲線法存活抱子的對(duì)數(shù)值N該法至少需要測(cè)試兩個(gè)樣品，并在設(shè)定溫度下(如121°C)分別取二個(gè)不同的曝?zé)釙r(shí)間。熱處理樣品及對(duì)照樣品(未經(jīng)熱處理)中的微生物數(shù)可采用二種方法：平皿計(jì)數(shù)法，或經(jīng)薄膜過濾并置于適當(dāng)培養(yǎng)基表面培養(yǎng)的方法。在培養(yǎng)終點(diǎn)，對(duì)每個(gè)樣品中的存活微生物(Ns)進(jìn)行計(jì)數(shù)，再將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值取常用對(duì)數(shù)(Lg)，并對(duì)相應(yīng)的曝?zé)釙r(shí)間F0(以分鐘為單位)作圖，可得到圖1所示的存活曲線。 °存活抱子的對(duì)數(shù)值N543210-1-2T=121C下的曝?zé)釙r(shí)間(分鐘)圖5.10121C下抱子的存活曲線在存活曲線上，從微生物差值為一個(gè)對(duì)數(shù)單位的二個(gè)點(diǎn)分別作x軸和y軸的相平行線，在x軸上即可求得D值；也可用下式計(jì)算(11)：D121c="怎凡一?) (19)舉例，D值測(cè)定中曝?zé)釙r(shí)間為5分鐘，而lgN為5，lgN為2，則0 SD121C=5/(5—2)=1.7分鐘從圖1中也可看出，D值為存活曲線斜率的負(fù)倒數(shù)(-1/k)。因此，D值可在存活曲線的直線段，用未加權(quán)最小二次方線性回歸分析法按下式求得：Zuy—(Zu)(Zy)/nK= (20)Zu2—(Zu)2/n式中，F(xiàn)。為曝?zé)釙r(shí)間的分鐘數(shù)，y為曝?zé)釛l件下存活菌落數(shù)的平均值，n指所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的組數(shù)?！?.5對(duì)數(shù)規(guī)則在非濕熱滅菌領(lǐng)域的應(yīng)用經(jīng)典的對(duì)數(shù)理論問世以來，國(guó)外很多學(xué)者對(duì)滅菌過程中微生物死亡的規(guī)律進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)工作，并對(duì)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，有的抱子在滅菌時(shí)，存活的對(duì)數(shù)值和滅以上圖中，入指初期滯呆型曲線北指始末滯呆型曲線；密旨非均一性存活曲線。與此同時(shí)，有不少學(xué)者提出了一些新的理論來解釋非線性原因，如多致命點(diǎn)理論，抱子耐熱非專一性理論認(rèn)為一個(gè)細(xì)胞一個(gè)以上的致命點(diǎn)滅活后，細(xì)胞才會(huì)死亡。抱子耐熱非專一性理論認(rèn)為抱子的耐熱性在滅菌過程中是變化的。這些理論過于復(fù)雜，難以在實(shí)際工作中應(yīng)用。于是，人們又從三個(gè)方面，即科學(xué)性，計(jì)算結(jié)果的安全性及使用的簡(jiǎn)便性對(duì)對(duì)數(shù)規(guī)則進(jìn)行了再評(píng)價(jià)。經(jīng)典的對(duì)數(shù)規(guī)則經(jīng)受住了考驗(yàn)并在實(shí)踐中獲得了發(fā)展。昔日在蒸汽滅菌領(lǐng)域起家的對(duì)數(shù)規(guī)則，如今對(duì)干熱滅菌、氣體滅菌及輻射滅菌的適用性已眾所周知。不管所采用的滅菌方法是熱力學(xué)的、化學(xué)的還是輻射的，在一定的滅菌條件下，微生物的死亡均遵循對(duì)數(shù)規(guī)則值，即使微生物下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需的時(shí)間或輻射劑量可從下式算或根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用作圖法求得。D=U/（LgN—LgNu）0式中，U—系指給定滅菌條件下的滅菌時(shí)間或輻射劑量；N0--芽抱的初始數(shù)值nU--滅菌后存活的抱子數(shù)。經(jīng)典理論的發(fā)展拓寬了它在滅菌領(lǐng)域的應(yīng)用范圍并為滅菌程序的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證提供了方便條件。應(yīng)當(dāng)注意，在輻射滅菌法中，0系微生物耐輻射參數(shù)，意指使污染菌下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需的劑量。3.5.1干熱滅菌如前所述，干熱滅菌是指在非飽和濕度下進(jìn)行的熱力學(xué)滅菌。因此，干熱滅菌時(shí)的相對(duì)濕度范圍可從99.9%至1%以下。干熱滅菌的介質(zhì)通常是被滅菌品所處濕度下的熱空氣，在滅菌過程中，通過強(qiáng)制方式將熱空氣對(duì)流。隨著熱空氣將水分逐漸帶走，被滅菌物品及芽抱跟著失水，從而導(dǎo)致滅菌率發(fā)生相應(yīng)的變化。干熱滅菌與濕熱滅菌的動(dòng)力學(xué)特征相似，但反應(yīng)機(jī)理卻有所不同。干熱滅菌是使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，因此，干熱滅菌需要較高的溫度條件。在制藥工業(yè)中，干熱滅菌被廣泛用于熱穩(wěn)定性好、但又不能經(jīng)受高壓蒸汽滅菌的物品，如甘油、油類、凡士林、石蠟。此外，它還可用于某些粉狀的藥物組份如滑石粉、磺胺類藥物以及玻璃和不銹鋼設(shè)備的滅菌。在干熱滅菌中，取】7此為參照溫度，相應(yīng)的滅菌時(shí)間以孔表示。盡管干熱滅菌過程中抱子的耐熱性會(huì)發(fā)生一些變化，但藥典規(guī)定的無菌保證值已有了相當(dāng)?shù)陌踩?，因此，除Z取20°C外，滅菌率的計(jì)算式與濕熱滅菌相同，。3.5.2干熱去熱原內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外側(cè)的脂多糖類物質(zhì)ipopolysaccharides)其中磷脂多糖體是其活性中心，致熱作用最強(qiáng)。磷脂多糖體是由多糖萄糖、半乳糖、庚糖、H-乙酰葡萄糖胺等糖組成通過KDO(2-Keto-3-deoxyoctona鍵而與磷脂A(LipidA結(jié)合組成一個(gè)單位結(jié)構(gòu)，許多這樣的單位結(jié)構(gòu)組成長(zhǎng)鏈的巨大分子。磷脂多糖體的化學(xué)組成因菌種不同而異，從大腸桿菌分離出來的磷脂多糖體中奄?69%的糖，12?13%的類脂化合物，7%的有機(jī)磷和其它一些成分。磷脂多糖體的分子量約新1Q?5x16，也有人認(rèn)為是7x105~?7x16，分子量越大致熱作用也越大。由于低劑量?jī)?nèi)毒素注入人體后便會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)，故而也稱之為熱原。任何旨在去除產(chǎn)品中所含的脂多糖的工藝過程均稱為去熱原工藝。干熱法是最為有效的去熱原方法之一。但是，去熱原要求的溫度很高，如170?250C，甚至更高。在170C下去熱原速度很慢，需約30分鐘方能使純內(nèi)毒素下降1個(gè)對(duì)數(shù)單位，而在250C下達(dá)到同樣效果僅需9秒鐘。對(duì)干熱去熱原工藝進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，通常直接向待去熱原物品中加入已知量的內(nèi)毒素，然后證明該工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位。在去熱原計(jì)算中，L的計(jì)算式相同，參照溫度取170C，Z取54C。

表4.1.5濕熱滅菌中不同溫度和值下的滅菌率(L)數(shù)據(jù)t/(dL值/(分)Z=7Z=8Z=9Z=10Z=11Z=121000.0010.0020.0060.0080.0120.0181010.0010.0030.0060.0100.0150.0221020.0020.0040.0080.0130.0190.0261030.0030.0060.0100.0160.0230.0321