抗角質蛋白抗體（AKA）檢測標準操作規(guī)程

抗角質蛋白抗體(AKA)檢測標準操作規(guī)程××醫(yī)院檢驗科臨床免疫室作業(yè)指導書文件編號:XXX生效日期：共頁第頁1.目的規(guī)范檢測抗角質蛋白抗體(AKA)的流程，確保檢測結果的準確性及重復性。2.原理間接免疫熒光法：將稀釋的血清與生物載片(反應區(qū)內固定有包被基質的生物薄片)溫育，如果樣本是陽性的，特異性IgG、IgA和IgM抗體與相應的抗原結合。在第二次溫育時，熒光素標記的抗人抗體與結合在生物基質上的抗體反應，形成熒光顯微鏡下所觀察到的特異性熒光模式。3.標本要求3．2·樣品收到后立即分離血清，不能及時測定的血清應于2~8℃保存。4.試劑與儀器5.操作步驟實驗準備：將1包磷酸鹽溶于1L蒸餾水，加入2ml吐溫20并充分混勻，配成磷酸鹽(PBS)吐溫緩沖液。本加入100μlPBS吐溫緩沖液中并充分混勻。5．3·加樣：將加樣板放在泡沫板上，將25μl稀釋后的血清樣本加至加樣板的每一反應生氣泡。5．4·溫育：將生物載片有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里，反應立即開始。應確保每一樣本均與生物薄片接觸且樣本間互不接觸。室溫(18~25℃)溫育30min。5．5·沖洗：用盛于燒杯內的PBS吐溫緩沖液沖洗載片，然后立即將生物載片浸入裝有PBS吐溫緩沖液的洗杯中，浸泡至少5min。有條件可使用旋轉搖床進行振蕩。5．6·加樣：將20μlFITC標記的熒光二抗加至潔凈加樣板的反應區(qū)上，待加完所有的熒光二抗后開始溫育。5．7·第二次溫育：從洗杯中取出一張生物載片，用吸水紙擦去背面和邊緣的水分后，立即蓋在加樣板的凹槽里。室溫(18~25℃)溫育30min。5．9·封片：將蓋玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油／PBS至蓋玻片：每一反應區(qū)約10μl。從洗杯中取出生物載片，用吸水紙擦干背面和邊緣的水分，將生物載片有生物薄片的一面朝下放在已準備好的蓋玻片上。6.校準定期對加樣槍和熒光顯微鏡進行校準。關鍵部件更換或者維修后也需校準。7.質控每批次的實驗應帶上陰性和弱陽性質控物，滴度結果的在控規(guī)則：陰性質控物必須陰性，陽性質控物結果在上下1個滴度內。8.結果判斷8．1·熒光模式(陽性反應)：AKA與大鼠食管冰凍切片反應，形成圍繞角質層細胞的線性熒光。熒光模式與陽性對照血清所顯示的基本一致。在大鼠食管其他部位產生的熒光都判斷為陰性反應。如果所有的細胞核或細胞漿染色，則存在ANA、AMA或其他細胞抗體(表所示表所示AKA結果判斷AKA反應性結果1∶10無熒光反應滴度1∶10或更高陰性，血清標本中未檢出AKA。表所示AKA滴度判讀在在以下稀釋度可觀察到的熒光強度抗體滴度1∶1000弱中強…1∶10000弱…1∶10001∶32001∶10000…弱中強強強…弱中強強強強強…注：以出現陽性核型的最高稀釋度作為檢測的結果。9.生物參考區(qū)間健康人血清或血漿中AKA為陰性，滴度＜1∶10。10.性能參數份特征性血清對同一批號產品進行檢測，每份血清檢測10次，陽性血清的結果特異性熒光強度基本一致，陰性血清結果為陰性。10．3·批間差異：用2份特征性血清對不同批號的產品進行檢測，陽性血清的結果特異性熒光強度基本一致，陰性血清結果為陰性。11.臨床意義RA患者中可檢測到不同的循環(huán)抗體，血清學檢測通常僅包括RF。AKA與該病的相關性已經明確。約50％RA患者可檢測到AKA(敏感性36％~39％)，并可在疾病早期被檢測到。約30％的RF陰性患者AKA陽性。很多研究表明RA早期檢測到AKA為疾病臨床進展的標志