醫(yī)學(xué)生物學(xué)克隆論文

醫(yī)學(xué)生物學(xué)克隆論文1結(jié)果與分析

1.1小桐子JcMSRA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆以小桐子葉片材料提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴(kuò)增JcMSRA基因cDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物約0.9kb(圖1A)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆(圖1B)。挑取陽性克隆過夜搖菌，提取重組質(zhì)粒pEASY-T1-JcMSRA(圖1C)，并以M13通用引物進(jìn)行測(cè)序。

1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息學(xué)分析經(jīng)測(cè)序分析，本討論克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全長(zhǎng)879bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框(780bp)，編碼259個(gè)氨基酸(圖2)。通過將JcMSRA編碼框與其基因組序列(Jcr4S03665,14648~16350位,1702bp)比對(duì)，發(fā)覺JcMSRA基因包含2個(gè)外顯子(長(zhǎng)度分別為528bp與252bp)與1個(gè)內(nèi)含子，且內(nèi)含子的序列(924bp)較2個(gè)外顯子都長(zhǎng)，符合AT/GT的剪切規(guī)章。ProtParam分析結(jié)果顯示，JcMSRA編碼的蛋白質(zhì)分子量為29.1kD，理論等電點(diǎn)為8.75，且單體亞基不穩(wěn)定，說明其屬于多聚體蛋白質(zhì)。

另外，該蛋白質(zhì)N端不含信號(hào)肽，猜測(cè)其亞細(xì)胞定位可能性最大的為線粒體、其次為細(xì)胞核。ExPASy的COILS猜測(cè)發(fā)覺，該蛋白質(zhì)在190~220位有一個(gè)明顯的卷曲螺旋區(qū)域(圖3A)。作為一種超二級(jí)結(jié)構(gòu)，卷曲螺旋一般由2~7個(gè)短的琢-螺旋組成，是很多轉(zhuǎn)錄因子與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)元件，該卷曲螺旋消失的位置正好是其二級(jí)結(jié)構(gòu)中琢-螺旋最長(zhǎng)的部位，與SOPM服務(wù)器猜測(cè)的結(jié)構(gòu)吻合(圖3B)。分別以大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果楊(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)與小桐子MSRA氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖4)，發(fā)覺MSRA氨基酸序列在N端與C端都沒有同源性，差異變化較大，而在中部相對(duì)保守。

MSRA屬于單結(jié)構(gòu)域蛋白，位于該酶蛋白活性中心的核心氨基酸殘基為Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(圖4,菱形標(biāo)注)，而-GCF-W-保守序列的Cys與C端的兩個(gè)保守Cys殘基主要起維持酶活性中心結(jié)構(gòu)的功能。將小桐子MSRA氨基酸序列進(jìn)一步與MSR家族的三類不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。由圖中可以看出，不同的MSR被聚類為明顯的三條分支，印證了MSR三個(gè)家族在氨基酸一級(jí)序列及高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面的進(jìn)化差異性。我們得到的小桐子MSR被歸入了MSRA分支中，與小桐子的近科物種毛果楊(Populustrichocarpa)在進(jìn)化上距離較遠(yuǎn)，序列相像性僅為22.19%，而與蕓豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的親緣關(guān)系較近，序列相像性分別為70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通過X-晶體射線衍射法已經(jīng)獲得了幾種(如大腸桿菌,毛果楊,牛)MSRA的高辨別率三維結(jié)構(gòu)。我們通過同源建模方法構(gòu)建了小桐子MSRA的三維空間結(jié)構(gòu)并進(jìn)行了氨基酸殘基能量評(píng)估(圖6)。綜合討論MSRA的晶體結(jié)構(gòu)顯示，其表面都有一個(gè)口袋狀結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)四周的氨基酸殘基相對(duì)保守，后被證明是底物甲硫氨酸亞砜的結(jié)合位點(diǎn)。小桐子MSRA蛋白的底物結(jié)合位點(diǎn)氨基酸構(gòu)成為Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最終兩位氨基酸Phe102、Trp103也參加了催化中心的形成(圖6A)，而-GCFW-保守序列結(jié)構(gòu)域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在維持結(jié)合位點(diǎn)空間結(jié)構(gòu)方面也是不行或缺的。

Ramachandram能量圖分析顯示有96.9%的氨基酸殘基處于能量穩(wěn)定區(qū)域，說明猜測(cè)的三維結(jié)構(gòu)可信(圖6B)。小桐子MSRA空間結(jié)構(gòu)核心區(qū)域是3段琢-螺旋包裹的6條茁-折疊片層結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)琢/茁卷狀，二級(jí)結(jié)構(gòu)組成挨次以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1與茁6較短，而核心4條茁-折疊較長(zhǎng)，在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上排列為反平行方式。另外，在茁2與茁3之間有1段極短的琢-螺旋，在琢2與茁4之間存在2條反平行的極短茁-折疊與1段極短琢-螺旋，而在靠近N末端還存在1段極短琢-螺旋，C端存在2段極短琢-螺旋。蛋白質(zhì)核心區(qū)域被兩端柔性區(qū)包裹，包括N端的92個(gè)氨基酸殘基(Met1-Glu92)與C端的33個(gè)氨基酸殘基(Ala227-Gly259)。

2爭(zhēng)論

甲硫氨酸亞砜還原酶作為生物體內(nèi)的抗氧化修復(fù)因子屬于多基因家族，目前已經(jīng)報(bào)道的甲硫氨酸亞砜還原酶有三個(gè)亞家族，不同家族雖然催化相像的反應(yīng)，但沒有一級(jí)氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)相像性(Rouhieretal.,2023)。最早被報(bào)道的兩個(gè)亞家族是MSRA與MSRB，MSRA與MSRB能夠分別特異性地還原Met-S-SO與Met-R-SO，且兩者既可以催化游離的甲硫氨酸亞砜，也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亞砜。第三個(gè)MSR家族最早在大腸桿菌中發(fā)覺，命名為fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而該酶只能催化游離的甲硫氨酸亞砜。

MSRA最早從大腸桿菌中分別出來的，是一類相對(duì)較小的胞質(zhì)酶，編碼該酶蛋白的基因廣泛存在于生物界，如梭狀芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金屬還原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜熱古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、擬南芥、楊樹、果蠅、小鼠、大鼠及人。該亞家族不同種屬間同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是特別保守的。在N端存在一個(gè)保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，這一序列的突變將導(dǎo)致MSRA完全失活；另外，在C端存在兩個(gè)保守的還原型Cys殘基，以上三個(gè)保守的Cys在空間結(jié)構(gòu)上共同參加MSRA催化中心的構(gòu)成(Rouhieretal.,2023)。MSRB最初也是從大腸桿菌中發(fā)覺的，且在黃單孢菌(Xanthomonascampestris)、梭狀芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、擬南芥、煙草、果蠅及人等生物體中都存在，屬多基因亞家族，在不同生物體(如人,小鼠等)中一般都有3個(gè)MSRB，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體，其N端定位信號(hào)肽在不同的MSRB中較為保守。MSRB在其N端同樣存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端僅存在一個(gè)保守的Cys殘基(Dingetal.,2023)。與MSRA不同，MSRB中還包含兩個(gè)-CXXC-保守序列，用于結(jié)合Zn2+或Fe2+，共同構(gòu)成MSRB的活性中心(Olryetal.,2023)。

目前關(guān)于MSRA與MSRB的表達(dá)、調(diào)控及作用機(jī)理的討論主要集中在微生物及動(dòng)物中，如大腸桿菌、酵母菌、小鼠及人等，而對(duì)于植物MSR的討論報(bào)道近幾年才漸漸增多，本討論中克隆的小桐子MSRA基因也是首次報(bào)道。討論發(fā)覺，擬南芥中至少存在5個(gè)編碼不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同時(shí)存在至少9個(gè)MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白楊中發(fā)覺9個(gè)MSR基因，包括5個(gè)MSRA與4個(gè)MSRB；在水稻中發(fā)覺4個(gè)MSRA與3個(gè)MSRB基因。利用在線軟件猜測(cè)發(fā)覺，不同的MSR在植物細(xì)胞中有不同的定位，目前發(fā)覺的包括細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2023)。芯片數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)都表明不同亞細(xì)胞定位的MSR有著不同的'組織表達(dá)模式，胞質(zhì)型MSR通常在全部組織器官中都有表達(dá)，葉綠體型MSR主要在綠色組織尤其是葉中表達(dá)。

Romero等(2023)通過RT-PCR分析了擬南芥不同MSR類型的組織表達(dá)特異性，結(jié)果表明，AtMRA4在除根以外的全部組織中的表達(dá)量都很豐富，其總表達(dá)量在全部MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表達(dá)量?jī)H次于AtMSRA4，且主要在根和莖中表達(dá)；而AtMSRA1和AtMSRA5在全部組織中的表達(dá)量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表達(dá)量在葉和其它綠色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMSRB9則主要在根中高表達(dá)。大量數(shù)據(jù)表明，各種生物與非生物脅迫可以誘導(dǎo)高等植物不同MSR基因的表達(dá)，強(qiáng)光與鹽脅迫可以劇烈誘導(dǎo)擬南芥質(zhì)體型AtMSRA4的表達(dá)(Gustavssonetal.,2023)。定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的AtMSRB3可清除在植物受冷脅迫時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的MetSO和ROS，過表達(dá)AtMSR-B3可以提高擬南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2023)。而水稻OsMSRB1.1在受到包括鹽、甘露醇、低溫、甲基紫精和ABA在內(nèi)的非生物脅迫時(shí)表達(dá)量上升，而高溫處理則會(huì)使OsMSRB1.1表達(dá)量下降(Guoetal.,2023)。以上事實(shí)說明MSR基因表達(dá)種類的多樣性與組織特異性、表達(dá)調(diào)控的簡(jiǎn)單性以及與植物應(yīng)答逆境脅迫的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)也示意其在植物抗逆性討論中的應(yīng)用前景。

3材料與方法

3.1試驗(yàn)材料及處理供試小桐子種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，用1.5%CuSO4消毒20min，無菌水漂洗5次，于26℃的恒溫培育箱中吸漲24h(李忠光和龔明,2023)。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水潮濕濾紙的白磁盤(24cm伊16cm)中，于相對(duì)濕度75%、晝夜溫度26/20℃、光周期16/8h的恒溫培育箱中萌發(fā)5d。之后將發(fā)芽的種子播于消毒的培育土中并于同樣恒溫培育箱中培育15d至其次片真葉綻開。取其次片真葉材料，液氮速凍后置于-80℃冰箱中用于RNA的提取。

3.2菌株與主要試劑大腸桿菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本試驗(yàn)室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成和測(cè)序由深圳華大基因有限公司完成。

3.3試驗(yàn)方法

3.3.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取0.2g小桐子葉片材料，根據(jù)王海波等(2023)的方法利用TransZolUp試劑提取并純化總RNA。以AnchedOli(dT)18為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一鏈cDNA。

3.3.2小桐子JcMSRA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆以擬南芥MSRA全長(zhǎng)mRNA序列(XM_002510-827.1)為種子序列，對(duì)我們高通量測(cè)序得到的小桐子低溫熬煉轉(zhuǎn)錄組(GenBank登錄號(hào):GAHK00000000.1)的45251條Unigenes進(jìn)行本地Blast，得到小桐子MSRA基因的序列Unigene850_JC-CK_1A(GAHK0-1013398,1714bp)。序列分析表明其包含全長(zhǎng)F(780bp)。以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cDNA克隆引物，并送深圳華大基因合成。引物序列為：上游F(5-ACACAACTTAACTCAACACGTCA-3)；下游R(5-AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC-3)。以3.3.1中反轉(zhuǎn)錄cDNA模板，使用TransStartTaqDNAPolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃5min寅[94℃30s,54.9℃30s,72℃1min]35寅72℃20min。擴(kuò)增完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用EasyPureQuickGelExtractionKit從瓊脂糖凝膠中回收目的基因片段(879bp)，并與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂LB抗性平板(LB-Amp垣I(xiàn)PTG垣X-gal)，過夜生長(zhǎng)，挑取白斑菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性克隆取名為pEASY-T1-JcMSRA，并送深圳華大公司利用pEASY-T1質(zhì)粒上的M13F與M13R通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息學(xué)分析利用Spidey軟件進(jìn)行克隆cDNA序列與基因組序列比對(duì)以確定JcMSRA基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)。利用BioEdit軟件將JcMSRAcDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線工具ProtParam計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)。利用WolfSpt在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)