食工基因工程的基本技術(shù)

食工基因工程的基本技術(shù)第1頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)4DNA重組技術(shù)技術(shù)6

基因文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)5核酸雜交技術(shù)第2頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)4DNA重組技術(shù)（一）基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)（二）基因工程的載體系統(tǒng)（三）連接、轉(zhuǎn)化與重組子鑒定第3頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)基因工程常用工具酶主要包括如下：1、限制性內(nèi)切酶3、連接酶2、DNA聚合酶4、其它修飾酶第4頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定義：指能識(shí)別特定的DNA序列并在一定的條件下可在識(shí)別位置或附近對(duì)DNA進(jìn)行切割的酶。1、限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclase)第5頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性內(nèi)切酶的種類ⅠⅡⅢ限制性活性+++甲基化酶活性+-+DNA識(shí)別序列+++切割特異性隨機(jī)專一

切割位點(diǎn)距識(shí)別位點(diǎn)10-25bP對(duì)ATP依賴性+-+對(duì)Mg2+依賴性+++蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同亞基單一成分2種不同的亞基

第6頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性核酸內(nèi)切酶的命名命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個(gè)字母＋種名的前兩個(gè)字母＋菌株或菌型代號(hào)（大寫(xiě)）＋空白＋發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：

EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)第7頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月屬名種名菌株Haemophilusinfluenzaed

嗜血流感桿菌d株H

in

dHin

dIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶。例子注意斜體哦！第8頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

Ⅱ型酶的特性：（1）識(shí)別序列：4-8堿基的特異序列，通常具有回文結(jié)構(gòu)：如EcoRI：GGCCAATTTTAA第9頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B、平頭末端(bluntend):

切割點(diǎn)位于識(shí)別位點(diǎn)的中間，切斷的DNA片斷具有平齊的末端（2）、切割方式：A、粘性末端(stickyend):

兩條DNA鏈上的切割點(diǎn)不一致，切斷的DNA片斷的末端上含有一條多個(gè)核苷酸的單鏈，包括5’端凸出和3’端凸出。產(chǎn)生兩種切割方式：第10頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）、產(chǎn)生

5’端凸出粘性（如EcoRI切點(diǎn)）CTTAAGGAATTC5’--3’

3’--5’

CTTAAG

GAATTC

5’--3’

3’--5’

①產(chǎn)生粘性末端第11頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2）、產(chǎn)生3‘粘性末末端：如PstI5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

CTGCAG

GACGTC

5’--3’

3’--5’

第12頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②產(chǎn)生平末端：TTTAAAAAATTT

TTT

AAA

AAA

TTTCCCGGGGGGCCC5′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′3′DraISmaI第13頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）同裂酶：①完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。第14頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如XmaI和

SmaI。②不完全同裂酶：第15頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月來(lái)源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時(shí)切割。如BamHI、BglⅡ、XhoⅡ等。（4）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHI5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第16頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性內(nèi)切酶活性單位U

：

限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。

限制性內(nèi)切酶活性:

在建議使用Buffer、溫度下，在20uL反應(yīng)體系中1小時(shí)使1μg入DNA完全酶切所需的酶。第17頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月星活性（staractivity）:

在非最適合的條件下酶的識(shí)別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。限制性內(nèi)切酶在使用中，使用不當(dāng)，會(huì)出現(xiàn)所謂的星活性。注意了??！第18頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。1）.DNA的純度

影響限制性內(nèi)切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度

dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。第19頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3）.溫度

不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。是影響限制酶活性的重要因素。4）.緩沖液(Buffer)商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：

維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；β－巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活。第20頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用時(shí)在冰上操作；取酶用干燥、滅菌、新的槍頭酶用量不能超過(guò)酶切總體積的10%；多種酶進(jìn)行酶切時(shí)，先低鹽后高鹽緩沖液；關(guān)心小貼士告訴你使用時(shí)注意事項(xiàng)：第21頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、連接酶（Ligase)連接酶種類：DNA連接酶和RNA連接酶DNA連接酶：

T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶DNA連接酶功能：

間斷修復(fù)

連接作用第22頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1）大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端。2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。（1）、兩種連接酶連接特點(diǎn)。DNA連接酶：第23頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動(dòng)物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中：

NAD+（2）.連接條件第24頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

效率：粘性末端>平端(100倍)；

5，突出>3，突出；

平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI1）連接所用的目的片段的狀態(tài)：（3）、影響連接效果的因素：第25頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；單價(jià)離子：150-200mMNaCl，提高連接效果；

PEG：5%以下可以提高連接效率連接效果最好在37℃，但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定;最佳連接溫度：12-16℃，較好的連接效果，互補(bǔ)又較穩(wěn)定;2）連接溫度：3）反應(yīng)液中的成分：第26頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目的或作用：4）插入片段與載體的濃度比例

載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。第27頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月?依賴DNA的聚合酶：DNA聚合酶I?依賴RNA的DNA聚合酶：逆轉(zhuǎn)錄酶?不依賴DNA的聚合酶：末端轉(zhuǎn)移酶2、DNA聚合酶（Polymerase）（1）DNA聚合酶類型：第28頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）基因工程中常用的DNA聚合酶1）、大腸桿菌DNA聚合酶2）、Klenowfragment

3）、T7DNA聚合酶4）、T4DNA聚合酶

5）、修飾過(guò)的T7DNA聚合酶6）、逆轉(zhuǎn)錄酶7）、TaqDNA聚合酶第29頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本性質(zhì)：

5‘→3‘的DNA聚合酶活性；

5‘→3‘的核酸外切酶活性；

3‘→5‘的核酸外切酶活性。1）、大腸桿菌DNA聚合酶I（DNApolI）第30頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Klenow酶的來(lái)源：

—大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶的基本性質(zhì)：

5‘→3‘的DNA聚合酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性2)、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）第31頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3）、T4、T7-DNA聚合酶基本特性：均具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性，3‘→5‘的核酸外切酶活性T4聚合酶3‘→5‘的核酸外切酶活性強(qiáng)，而T7聚合酶5‘→3‘的DNA聚合酶活性第32頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月依賴于RNA的DNA聚合酶,最主要用途，以mRNA為模板合成cDNA3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTT5’mRNAoligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP4)、反轉(zhuǎn)錄酶第33頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5)、TaqDNA聚合酶

特點(diǎn)：

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75℃，對(duì)95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性。用途：

主要用于DNA的體外擴(kuò)增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）第34頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）DNA聚合酶的用途：DNA片斷探針的標(biāo)記DNA分子的體外合成DNA分子的體外突變DNA分子的序列分析DNA分子的修復(fù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第35頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、其它修飾酶堿性磷酸酶：功能為去除DNA或RNA5‘－末端的磷酸反應(yīng)，包括：

?來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸酶（CIP）

?來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸酶（BAP）磷酸激酶：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸，常用于探針標(biāo)記其它酶：核酸外切酶III、VII、S1核酸酶、RNaseA、DNaseⅠ第36頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）基因工程的載體系統(tǒng)第37頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月載體的功能：運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力；為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。第38頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；具有合適的篩選標(biāo)記；具有較高的外源DNA的載裝能力；具有多克隆位點(diǎn)（MCS）；具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。載體應(yīng)具備的條件：第39頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。

第40頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征：（1）質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)——質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。

?嚴(yán)緊型：1-3拷貝

?松弛型：10-60拷貝

是存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因。第41頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）質(zhì)粒的不相容性●定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性?！穹肿訖C(jī)理：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。第42頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性，如F、Col、R質(zhì)粒等（4）攜帶特殊的遺傳標(biāo)記：

?物質(zhì)抗性：如抗生素、重金屬離子

?物質(zhì)合成：如細(xì)菌毒素、有機(jī)堿第43頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月抗生素基因：blaorampr:抗氨芐青霉素catoramlr:抗綠霉素kanorkanr:抗卡那霉素strorstrr:抗鏈霉素tetortetr:抗四環(huán)素第44頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第45頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、噬菌體載體——（bacteriumphage）噬菌體-細(xì)菌病毒，由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成；噬菌體類型：溫和型和烈性兩種第46頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、噬菌體載體屬溫和型噬菌體；具有COS黏性末端；類型分為：替換型和插入型；

替換型載體-可插入12-25KB的片段

插入型載體-可克隆小于10KB的片段第47頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、柯斯質(zhì)粒(Cosmid）是一種帶有黏性末端位點(diǎn)的質(zhì)粒構(gòu)建：是一種以噬菌體為基礎(chǔ)為克隆大片段而設(shè)計(jì)并和質(zhì)粒共同構(gòu)建的雜合載體，具有噬菌體的COS位點(diǎn)和質(zhì)粒的復(fù)制子，具有噬菌體和質(zhì)粒的雙重特征。第48頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第49頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月柯斯質(zhì)粒載體的特征：1、具有噬菌體的特點(diǎn):具有COS位點(diǎn)-體外包裝成噬菌體顆粒環(huán)化，不形成噬菌斑2、具有質(zhì)粒載體的特點(diǎn):在寄主內(nèi)復(fù)制和具抗生素抗性基因。3、克隆能力強(qiáng)：40-50KB第50頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、人工染色體載體類型BAC：bacterialartificialchromosomes

，細(xì)菌人工染色體YAC：yeastartificialchromosome，酵母人工染色體TAC：transferartificialchromosome,可轉(zhuǎn)化人工染色體第51頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月oriS基因和repE基因是載體復(fù)制所必需第52頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第53頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（三）連接、轉(zhuǎn)化與重組子鑒定3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）重組DNA技術(shù)的操作過(guò)程:1、DNA的體外切割與連接2、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）第54頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、DNA連接過(guò)程:思考題：具有不同的粘性末端的DNA如何連接？第55頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月思考：DNA連接后接下來(lái)再干什么？第56頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)、增）（1）轉(zhuǎn)化的方法A、Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（化學(xué)法）B、電穿孔轉(zhuǎn)化第57頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A、化學(xué)法（CaCl2法)：（2）轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。第58頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)，在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。B、電穿孔轉(zhuǎn)化：第59頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）、轉(zhuǎn)化率定義另一表述：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，獲得的克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子受體細(xì)胞不長(zhǎng)）。定義：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。第60頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)化效率越低；受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。第61頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

——進(jìn)行選擇的目的：

借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。第62頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型：（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法（1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法（2）基于克隆DNA序列檢測(cè)法第63頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）、基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)抗藥性篩選法；顯色篩選法。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法；根據(jù)載體遺傳標(biāo)記特點(diǎn)，可細(xì)分為：第64頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori抗藥性篩選法：抗藥類型：氨芐青霉素卡那霉素四環(huán)素氯霉素鏈霉素第65頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月顯色篩選法：第66頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月限制性酶切圖譜法；菌落（噬菌斑）原位雜交法；

DNA序列分析法。

PCR擴(kuò)增法（2）根據(jù)克隆DNA序列檢測(cè)第67頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori限制性酶切圖譜法第68頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA序列分析法。Sanger雙脫氧法第69頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）基于插入外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)：免疫化學(xué)檢測(cè)法：聚丙烯酰胺凝膠電泳法。包括抗體測(cè)定法（如ELISA法）、免疫沉淀法前提條件：克隆基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)第70頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在瓊脂培養(yǎng)基中加入目標(biāo)蛋白的特異性抗體，目的重組子菌落會(huì)分泌出目標(biāo)蛋白，后者與特異性抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，在菌落周圍形成白色的圓斑。免疫化學(xué)檢測(cè)－－免疫沉淀鑒定：第71頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月免疫化學(xué)檢測(cè)－－ELISA法第72頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

聚丙烯酰胺凝膠電泳法。第73頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月技術(shù)5核酸雜交技術(shù)(Nucleicacidhybridization)第74頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

互補(bǔ)的核苷酸序列通過(guò)Waltson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈DNA分子、DNA-RNA分子的過(guò)程稱為雜交。一、核酸分子雜交的定義第75頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、核酸雜交類型Southern雜交：Northern雜交：Western雜交：菌落原位雜交：主要類型：DNARNA蛋白質(zhì)DNA探針DNADNA抗體DNA被檢測(cè)對(duì)象其它：原位雜交：FISH、GISH

斑點(diǎn)(dot)雜交和狹槽(slot)雜交。

第76頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、雜交三要素1、探針（DNA、RNA或抗體）包括探針的來(lái)源和標(biāo)記2、被檢測(cè)的對(duì)象（DNA、RNA或蛋白質(zhì)）包括被檢測(cè)樣品的分離準(zhǔn)備3、雜交膜

--硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman541濾紙第77頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、探針§1、探針的分類按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標(biāo)記物的不同：可分放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；§2、探針的標(biāo)記方法雙鏈DNA探針標(biāo)記主要方法：

A、切口平移法

B、隨機(jī)引物合成法第78頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月DNA聚合酶Ⅰ：合成DNA鏈作用A、切口平移法AGDNA酶Ⅰ打開(kāi)缺口作用DNA聚合酶Ⅰ涉及的相關(guān)酶：DNA酶Ⅰ：打缺口作用B、隨機(jī)引物合成法§原理：是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在

Klenow酶的作用下,合成DNA探針。第79頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月四、Southern雜交

第80頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、Southern雜交操作步驟:(1)用限制性內(nèi)切酶酶切DNA,經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段；(2)轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；轉(zhuǎn)膜方式：毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、真空印跡法、電轉(zhuǎn)移法。

(6)自顯影檢查目的DNA所在的位置。(3)預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點(diǎn)；(4)雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5)洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；第81頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、

Southern雜交影響因子分析1）、目的DNA在總DNA中所占的比例3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量2）、探針的大小和標(biāo)記效率4）、探針與靶DNA的同源性第82頁(yè)，課件共91頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3、Southern雜交的目的與用途§目的：用來(lái)檢測(cè)被研究DNA中（包括經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段或PC