真菌及四體 真菌

真菌及檢驗(yàn)

一類(lèi)具有典型細(xì)胞核，有核膜和核仁，胞漿內(nèi)有完整的細(xì)胞器，無(wú)根、莖、葉，不含葉綠素，無(wú)光合色素，細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)和纖維素的單細(xì)胞或多細(xì)胞異養(yǎng)真核細(xì)胞型微生物。延時(shí)符真菌的生物學(xué)性狀一、形態(tài)與結(jié)構(gòu)

真菌按形態(tài)、結(jié)構(gòu)可分為單細(xì)胞真菌和多細(xì)胞真菌兩大類(lèi)。1.單細(xì)胞真菌酵母菌：孢子，無(wú)菌絲類(lèi)酵母菌：芽生孢子，假菌絲單細(xì)胞真菌形態(tài)類(lèi)酵母菌—白假絲酵母菌芽生孢子假菌絲2.多細(xì)胞真菌絲狀菌（霉菌）：菌絲和孢子多細(xì)胞真菌形態(tài)菌絲hypha在環(huán)境適宜情況下由孢子長(zhǎng)出芽管，逐漸延長(zhǎng)呈絲狀，稱(chēng)菌絲。1.根據(jù)生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的菌絲的功能不同分為：營(yíng)養(yǎng)菌絲氣生菌絲生殖菌絲2.根據(jù)菌絲有無(wú)隔膜分為：有隔菌絲：多數(shù)為致病性真菌無(wú)隔菌絲孢子（spore)：

真菌的繁殖器官。一條菌絲可長(zhǎng)出多個(gè)孢子。在適宜條件下，孢子可發(fā)芽伸出芽管形成菌絲。區(qū)別要點(diǎn)真菌孢子細(xì)菌芽胞大小較大較小形態(tài)多種多樣圓形或橢圓形抵抗力不強(qiáng),60℃~70℃短時(shí)間即死強(qiáng),煮沸短時(shí)間不死數(shù)目一條菌絲可產(chǎn)生多個(gè)孢子一個(gè)細(xì)菌體只形成一個(gè)芽胞作用為繁殖方式之一不是繁殖方式位置可在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外形成只在細(xì)胞內(nèi)形成真菌孢子與細(xì)菌芽胞的區(qū)別孢子的分類(lèi)有性孢子：同一或者不同菌體上兩性細(xì)胞融合減數(shù)分裂而成無(wú)性孢子：菌絲上細(xì)胞分化生成，不發(fā)生細(xì)胞融合。無(wú)性孢子分生孢子葉狀孢子孢子囊孢子芽生孢子厚膜孢子關(guān)節(jié)孢子小分生孢子大分生孢子大分生孢子芽生孢子厚膜孢子孢子囊孢子二、真菌的繁殖與培養(yǎng)（一）繁殖方式1.無(wú)性繁殖

芽管繁殖分裂繁殖出芽繁殖生隔繁殖

2.有性繁殖

有性繁殖過(guò)程一般包括下列三個(gè)階段：質(zhì)配、核配和減數(shù)分裂（二）培養(yǎng)特性1.生長(zhǎng)特點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)要求不高低溫度（淺部真菌）低PH(4.0-6.0）高濕度和氧2.培養(yǎng)基沙保(Sabouraud)培養(yǎng)基類(lèi)酵母型菌落酵母型菌落3.菌落1.單細(xì)胞真菌酵母型菌落類(lèi)酵母型菌落（假菌絲）2.多細(xì)胞真菌絲狀菌落絲狀菌落三、真菌的抵抗力與變異性抵抗力較強(qiáng)，但不耐熱60℃1h可被殺死。對(duì)2%石炭酸、2.5%碘酒、0.1%升汞或10%甲醛溶液較敏感。

灰黃霉素、制霉菌素B、克霉素、酮康唑、伊曲康唑等對(duì)真菌有抑制作用。

形態(tài)、結(jié)構(gòu)變異、菌落變異和抗藥性變異。四、真菌的感染致病性真菌感染條件致病性真菌感染超敏反應(yīng)性疾病毒素中毒毒素與致癌

延時(shí)符真菌感染的檢驗(yàn)一、標(biāo)本的采集和處理

1.標(biāo)本的采集——根據(jù)真菌感染部位采集不同的標(biāo)本。取毛發(fā)、皮屑、指（趾）甲等標(biāo)本取痰液、膿汁、血液、腦脊液等標(biāo)本深部真菌感染淺部真菌感染標(biāo)本來(lái)源要適宜用藥前采集標(biāo)本嚴(yán)格無(wú)菌操作標(biāo)本量要充足立即送檢2.標(biāo)本采集注意事項(xiàng)臨床標(biāo)本分離培養(yǎng)直接檢查免疫學(xué)檢查觀察菌落生化反應(yīng)染色鏡檢直接鏡檢3.檢驗(yàn)程序核酸檢測(cè)其他鑒定試驗(yàn)形態(tài)學(xué)檢查病理組織標(biāo)本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鏡檢PASHE二、檢驗(yàn)方法(一)直接鏡檢標(biāo)本處理液：（1）KOH溶液：適于檢查致密的難以透明的材料。（2）生理鹽水：用于觀察真菌的出芽現(xiàn)象。（3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力較強(qiáng)，只限于不透明標(biāo)本。鏡檢（加溫）毛發(fā)或皮屑等注意真菌與其他混雜物的鑒別標(biāo)本+標(biāo)本處理液革蘭染色：各種真菌均為革蘭陽(yáng)性（圖1）。乳酸酚棉藍(lán)染色：染成藍(lán)色（圖2）。墨汁染色：背景染成黑色，菌體不著色（圖3）。熒光染色：熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。糖原染色：多糖成分呈紅色，核為藍(lán)色，背景為淡綠色。（圖1）（圖3）（圖2）（一）基本條件1.常用工具平皿、試管、接種針、接種環(huán)、接種鉤、培養(yǎng)箱等。三、分離培養(yǎng)與鑒定2.培養(yǎng)基真菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，最適pH4.0～6.0。常用的培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱(chēng)培養(yǎng)基用途沙氏培養(yǎng)基真菌的常規(guī)培養(yǎng)放線菌酮-氯霉素瓊脂真菌的常規(guī)培養(yǎng)玉米粉吐溫-80瓊脂觀察白假絲酵母菌的厚膜孢子馬鈴薯葡萄糖瓊脂

觀察真菌菌落色素，用于鑒別尿素瓊脂生化反應(yīng)鑒別培養(yǎng)（紅色癬菌和石膏樣癬菌）心腦浸液葡萄糖血瓊脂顯色鑒定培養(yǎng)基深部真菌培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)與鑒定（二）培養(yǎng)方法僅用于培養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖較快真菌。觀察真菌結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。多用于菌種傳代接種與保存。試管培養(yǎng)法大培養(yǎng)法小培養(yǎng)法玻璃棒載玻片培養(yǎng)基蓋玻片無(wú)菌蒸餾水(三)生長(zhǎng)現(xiàn)象

類(lèi)酵母型菌落絲狀菌落觀察菌落生長(zhǎng)速度、菌落大小、表面形態(tài)、性質(zhì)、顏色、邊緣、底部等。酵母型菌落糖（醇）類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)真菌對(duì)單糖、多糖、醇類(lèi)等發(fā)酵情況。同化碳源試驗(yàn)檢測(cè)真菌對(duì)糖類(lèi)中的碳源利用能力的試驗(yàn)，主要用于鑒定酵母菌。同化氮源試驗(yàn)檢測(cè)真菌對(duì)氮源利用能力的試驗(yàn)，主要用于鑒定酵母菌。明膠液化試驗(yàn)?zāi)承┱婢哂忻髂z酶，可分解明膠蛋白，使其失去凝膠性質(zhì)而不能凝固。尿素分解試驗(yàn)?zāi)承┱婢哂心蛩孛?，可分解尿素?、常用生化試驗(yàn)(四)真菌的鑒定方法2、免疫學(xué)檢查皮膚試驗(yàn)提取真菌抗原，進(jìn)行皮內(nèi)注射或斑貼試驗(yàn)，觀察注射或試驗(yàn)部位有無(wú)紅腫硬結(jié)出現(xiàn)。血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)真菌的抗原或抗體，例如：膠乳凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫分析等。3、其它鑒定診斷方法(l)厚膜孢子形成試驗(yàn)接種玉米粉吐溫-80瓊脂

25℃孵育1~3天待測(cè)菌每天于顯微鏡下觀察應(yīng)用：白假絲酵母菌的鑒定。方法：結(jié)果：白假絲酵母菌在72小時(shí)內(nèi)可觀察到豐富的假

菌絲，假菌絲頂端見(jiàn)1～2個(gè)厚膜孢子。厚膜孢子假菌絲2.芽管形成試驗(yàn)

方法：待測(cè)菌+0.5～1ml血清37℃水浴2～3小時(shí)鏡檢應(yīng)用：白假絲酵母菌的鑒定。3、其它鑒定診斷方法結(jié)果：絕大部分白假絲酵母菌可形成典型放大鏡柄狀芽管。芽管3、其它鑒定診斷方法

動(dòng)物接種病理組織檢查核酸檢測(cè)真菌毒素的檢測(cè)用于分離病原性真菌、確定致病性、研究抗真菌藥物。用于深部真菌感染的診斷。用于真菌的分型鑒定。有ELISA、薄層層析法、高效液相色譜法等多種方法。G試驗(yàn)用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期診斷。（四）真菌藥物敏感性試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)?zāi)康闹笇?dǎo)臨床用藥。監(jiān)控耐藥菌株的發(fā)生和耐藥性變化。預(yù)期研究新藥的潛在療效。(一)臨床常用抗真菌藥物據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)多烯類(lèi)：如兩性霉素B、制霉菌素等。吡咯類(lèi)：如酮康唑、伊曲康唑等。其他：如氟胞嘧啶。據(jù)作用機(jī)制分類(lèi)作用于真菌細(xì)胞膜：如兩性霉素B等。作用于真菌細(xì)胞壁：如尼可霉素Z等。干擾真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等。其他：如大蒜新素及冰醋酸等。（二）酵母菌藥敏試驗(yàn)方法——微量稀釋法1．試驗(yàn)前準(zhǔn)備RPMI1640培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺、酚紅，不含碳酸氫鈉）培養(yǎng)基以培養(yǎng)基依次作10倍稀釋?zhuān)瑵舛确秶涸簙10倍于試驗(yàn)終濃度。藥液稀釋配成最高試驗(yàn)濃度的10倍（水溶性藥物）或100倍（脂溶性藥物）。藥物原液配制用培養(yǎng)基稀釋成1×103～5×103CFU/ml待檢菌液制備2．方法稀釋藥物將藥液加至無(wú)菌96孔微量板各孔接種0.1ml工作濃度的菌液35℃孵育48h（假絲酵母菌）或72h（新型隱球菌），觀察結(jié)果3．結(jié)果判斷

4.質(zhì)量控制

采用標(biāo)準(zhǔn)菌株作為每次測(cè)定質(zhì)控菌株，其MIC應(yīng)落在預(yù)期值范圍內(nèi)。MIC通常指完全抑制待測(cè)菌生長(zhǎng)（孔內(nèi)液體完全透明）的最低藥物濃度。吡咯類(lèi)和氟胞嘧啶：與對(duì)照孔相比50%生長(zhǎng)被抑制的最低藥物濃度。（二）酵母菌藥敏試驗(yàn)方法——紙片擴(kuò)散法1．試驗(yàn)前準(zhǔn)備培養(yǎng)基商品化含藥物紙片藥物紙片用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝淮龣z菌液制備含葡萄糖和亞甲藍(lán)的M-H瓊脂（二）酵母菌藥敏試驗(yàn)方法——紙片擴(kuò)散法2．方法用無(wú)菌棉簽蘸取菌液

35℃孵育18~24小時(shí)若生長(zhǎng)不良可延長(zhǎng)至48小時(shí)貼上藥物紙片均勻涂布接種M-H瓊脂藥物紙片接種菌液

質(zhì)量控制——

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)直徑必須質(zhì)控允許范圍。（二）酵母菌藥敏試驗(yàn)方法——紙片擴(kuò)散法

結(jié)果判斷讀取<80%抑制生長(zhǎng)時(shí)的抑菌環(huán)直徑，環(huán)內(nèi)的微小菌落（20%）可忽略不計(jì)。據(jù)抑菌環(huán)直徑判斷結(jié)果。延時(shí)符常見(jiàn)病原性真菌及檢驗(yàn)

淺部感染真菌一、皮膚癬真菌分表皮癬菌屬、毛癬菌屬和小孢子癬菌屬3個(gè)屬，可侵犯皮膚、指（趾）甲和毛發(fā)，引起人類(lèi)的體癬、股癬、手癬、足癬、甲癬、頭癬等。體癬股癬手癬一、皮膚癬真菌頭癬足癬甲癬表皮癬菌屬對(duì)人致病的是絮狀表皮癬菌。鏡檢可見(jiàn)大分生孢子、菌絲較細(xì)有分隔、厚膜孢子。絮狀表皮癬菌菌落絮狀表皮癬菌大分生孢子、厚膜孢子絮狀表皮癬菌菌落毛癬菌屬常見(jiàn)的致病菌有紅色毛癬菌、紫色毛癬菌、須毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌和許蘭毛癬菌。紅色毛癬菌菌落正面紅色毛癬菌菌落背面紫色毛癬菌菌落2.毛癬菌屬：須毛癬菌菌落斷發(fā)毛癬菌菌落許蘭毛癬菌菌落毛癬菌屬顯微鏡下可見(jiàn)大分生孢子、小分生孢子；菌絲形態(tài)多樣。紅色毛癬菌小分生孢子紫色毛癬菌菌絲紅色毛癬菌大分生孢子2.毛癬菌屬：斷發(fā)毛癬菌小分生孢子及菌絲許蘭毛癬菌菌絲須毛癬菌大、小分生孢子3．小孢子癬菌屬常見(jiàn)的致病菌有鐵銹色小孢子菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌等。鐵銹色小孢子菌菌落石膏樣小孢子菌菌落犬小孢子菌菌落3．小孢子癬菌屬鏡下可見(jiàn)菌絲、厚壁梭形大分生孢子。犬小孢子菌大分生孢子石膏樣小孢子菌大分生孢子鐵銹色小孢子菌菌絲（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)1．標(biāo)本采集采集皮屑、甲屑、病發(fā)。2．檢驗(yàn)方法直接鏡檢：查找菌絲和孢子。分離培養(yǎng)與鑒定：觀察菌落顏色和形態(tài)；毛發(fā)穿孔試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)和特殊營(yíng)養(yǎng)需要試驗(yàn)。深部感染真菌一、念珠菌（一）生物學(xué)特性在沙培養(yǎng)基上呈類(lèi)酵母型菌落，菌體呈圓形或卵圓形，G+，可形成假菌絲、厚膜孢子。白假絲酵母菌菌落芽生孢子與假菌絲假菌絲與厚膜孢子（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)1．標(biāo)本采集分泌物、痰、尿、糞、血或腦脊液等。2．檢驗(yàn)方法直接鏡檢分離培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)：芽管形成試驗(yàn)、厚膜孢子形成試驗(yàn)、TTC試驗(yàn)、糖同化或發(fā)酵試驗(yàn)。（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)?其他檢測(cè)

?藥敏試驗(yàn)

芽管形成試驗(yàn)厚膜孢子形成試驗(yàn)顯色培養(yǎng)基（三）臨床意義可引起：①皮膚假絲酵母菌?。虎陴つぜ俳z酵母菌?。虎蹆?nèi)臟假絲酵母菌??；④中樞神經(jīng)系統(tǒng)白假絲酵母菌病。鵝口瘡指間念珠菌病二、新型隱球菌（一）生物學(xué)特性墨汁負(fù)染色后，可見(jiàn)圓形或卵圓形菌體，外周有寬厚莢膜，形成酵母型菌落。新型隱球菌菌落新型隱球菌莢膜（二）微生物學(xué)檢驗(yàn)1．標(biāo)本采集腦脊液、痰液、尿液、膿汁等。2．檢驗(yàn)方法直接鏡檢分離培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)

：酚氧化酶試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、糖同化及發(fā)酵試驗(yàn)。其他檢測(cè)藥敏試驗(yàn)（三）臨床意義經(jīng)呼吸道侵入人體，引起肺部感染。由肺經(jīng)血行播散時(shí)可引起亞急性或慢性腦膜炎。肺新型隱球菌感染三、其他重要真菌（一）曲霉在沙保培養(yǎng)基上形成絲狀菌落，由于產(chǎn)生分生孢子而漸呈現(xiàn)不同顏色。煙曲霉菌落黃曲霉菌落黑曲霉菌落構(gòu)巢曲霉菌落土曲霉菌落